Мышиная модель праймированного микобактериального увеита для изучения постинфекционного увеита

Аннотация

Источник: John, S., et al. Primed Mycobacterial Uveitis (PMU) как модель постинфекционного увеита. J. Vis. Exp. (2021).

Это видео демонстрирует метод создания мышиной модели праймированного микобактериального увеита (PMU) для изучения постинфекционного увеита. При индукции ПМУ путем интравитреального введения убитой теплом микобактерии туберкулеза у мыши, ранее иммунизированной тем же иммуногеном, прогрессирование хронического воспаления в глазу анализируют с помощью визуализации и гистопатологического исследования

Протокол

Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.

1. Препарат антигена для подкожного введения

1. Выполняйте все процедуры, описанные в этом отделении, в химическом вытяжном шкафу для предотвращения вдыхания или контакта с кожей порошком Mycobacterium tuberculosis (Mtb) H37Ra. Обращайтесь в соответствии с политикой вашего учреждения для полного адъюванта Фрейнда (обычно BSL-1). Это включает в себя использование химически стойких перчаток, защитных очков и защитной рабочей одежды (лабораторного халата).
2. Используйте хорошую стерильную технику, чтобы предотвратить загрязнение реагентами, которые будут вводиться подопытным животным.
3. Приготовьте суспензию Mtb в фосфатно-солевом буфере (PBS), смешав 5 мг лиофилизированного, убитого при нагревании порошка Mtb H37Ra с 2,5 мл холодного PBS в микроцентрифужной пробирке объемом 5 мл. Сделайте вихрь один раз на 30 секунд и затем поместите на лед.
4. Чтобы получить тонкую суспензию H37Ra в PBS, ультразвуком обрабатывайте суспензию на льду в течение 5 минут.
   1. Разжмите корпус блока преобразователя и очистите щуп 70% спиртовым тампоном.
   2. Включите ультразвуковую аппарат, установите мощность на 4, повернув ручку регулировки питания, и погрузите наконечник зонда в порошок микобактерий, содержащий PBS. Убедитесь, что наконечник зонда погружен по крайней мере на половину глубины образца и что наконечник зонда не касается стенки микроцентрифужной пробирки.
5. Обрабатывайте смесь ультразвуком на льду в течение 30 секунд, сделайте паузу в течение 30 секунд и повторяйте в общей сложности 5 минут, чтобы полностью диспергировать порошок в однородную суспензию без нагрева жидкости.
6. Добавьте в смесь 2,5 мл неполного адъюванта Фройнда и повторяйте процесс ультразвука на льду до тех пор, пока эмульсия не образует консистенцию, похожую на зубную пасту.
7. Установите мощность на 0 с помощью ручки управления и выключите устройство, чтобы завершить ультразвуковую обработку. Снимите наконечник с суспензии и протрите щуп спиртовым тампоном.
8. Храните антигенную эмульсию при температуре 4 °C. Приготовление партий эмульсии поможет обеспечить согласованность между экспериментами. Эмульсия может храниться при температуре 4 °C до 3 месяцев.

2. Подкожная инъекция

1. Выполните подкожную инъекцию за неделю до интравитреальной инъекции (ИВТ) (обозначена как день -7).
2. Загрузите микобактериальную эмульсию в шприц объемом 1 мл (без иглы). Из-за вязкости и непрозрачности эмульсии трудно различимые пузырьки воздуха могут заполнять шприц.
   1. Чтобы предотвратить образование пузырьков воздуха в шприце, после загрузки 0,2-0,3 мл эмульсии переверните шприц кончиком вверх и осторожно постучите шприцем несколько раз по краю прилавка, чтобы вывести пузырьки на поверхность.
3. Выдавите воздух из шприца и продолжайте наполнять шприц. Переверните и периодически постукивайте до полного заполнения.
4. Поместите иглу 25 г на шприц и направьте эмульсию до заполнения иглы. Храните шприц на льду до использования.
5. Чтобы безопасно выполнить подкожную инъекцию, либо обезболите мышь, либо используйте гуманные методы сдерживания, которые обеспечивают легкий доступ к задним конечностям животного.
6. Для обезболивания для подкожного введения поместите животное в индукционную камеру изофлурана (3%-4% для индукции и 1%-3% для поддержания). После обезболивания убедитесь, что у мыши медленный темп дыхания и нет признаков респираторного дистресса.
7. Подкожные инъекции следует делать либо на тыльную поверхность бедер, либо на вентральную поверхность ног, расположенную проксимальнее области паховых лимфатических узлов.
   1. Осторожно введите иглу, чтобы предотвратить инъекцию в мышцу. Введите 0,05 мл эмульсии Mtb в подкожное пространство. Не удаляйте иглу сразу, чтобы дать возможность полностью впрыснуть густую эмульсию.
   2. Повторите инъекцию с левой и правой стороны в общей сложности 0,1 мл на животное.
8. Если мышь находится под наркозом, положите ее на теплую грелку до полного выздоровления. Не оставляйте мышь без присмотра до тех пор, пока она не придет в сознание, достаточное для поддержания лежачего положения на грудине.
9. После полного выздоровления верните мышь в клетку и пометьте карту клетки датой подкожной инъекции.
10. Обеспечьте обезболивание пероральным ацетаминофеном (200 мг/кг/сут), но не нестероидными противовоспалительными препаратами (НПВП), поскольку противовоспалительные средства могут влиять на индукцию увеита.

3. Препарат антигена для интравитреального введения

1. Выполняйте все процедуры, описанные в этом разделе, в соответствующих стерильных условиях, чтобы предотвратить контаминацию интравитреальной суспензии Mtb.
2. Делают интравитреальные суспензии.
   1. Для индукции панувеита легкой и средней степени тяжести приготовьте интравитреальную суспензию в концентрации 5 мг/мл, добавив 5 мг экстракта микобактерий к 1 мл 1x PBS.
   2. Для индукции умеренного и тяжелого панувеита приготовьте интравитреальную суспензию в концентрации 10 мг/мл, добавив 10 мг экстракта микобактерий в 1 мл 1x PBS.
3. Сделайте вихрь один раз на 30 секунд и затем поместите на лед.
4. Чтобы получить тонкую суспензию H37Ra в PBS, ультразвуком обрабатывайте суспензию на льду в течение 10 минут, как описано в шаге 1.4. Распределите этот стоковый раствор в объеме 100 мкл и храните при температуре -20 °C.
5. Перед использованием размораживайте при комнатной температуре и делайте вихри на высокой мощности в течение 1 мин. Держите аликвоты на льду во время транспортировки их в помещение для животных.

4. Процедура интравитреальной инъекции в день 0

1. Подготовка животных
   1. Наденьте подогнанные смотровые перчатки и положите мышь на весы, чтобы узнать ее вес в граммах.
   2. Введите внутрибрюшинную инъекцию 0,02 мл/г массы тела раствора, содержащего 100 мг/мл кетамина и 20 мг/мл ксилазина, смешанного со стерильной водой, для обезболивания животного. Альтернативный подход включает индукцию с использованием ~1,5% изофлурана (ингаляционного).
   3. Подождите примерно 2 минуты, пока мышь заснет, а затем поместите мышь в грелку и накройте крышкой. Проведите тесты на болевой рефлекс, такие как щипывание ушей, пальцев ног и хвоста, чтобы оценить глубину анестезии для процедуры.
   4. После сна обезболите роговицу 1 каплей 0,5% (v/v) тетракаина. Избегайте попадания тетракаина в нос или рот мыши. Через 10 секунд промокните лишнюю жидкость.
      заметка: Было замечено, что дилатация радужной оболочки и визуализация передней камеры (ПК) улучшаются при применении местной анестезии, возможно, за счет улучшения подавления роговичного рефлекса при комбинированной системной и местной анестезии. Однако при желании этот шаг можно опустить.
   5. Расширьте зрачок с помощью 1 капли 2,5% (v/v) фенилэфрина. Соблюдайте осторожность, чтобы избежать попадания излишков капель в нос или рот. Через 2-3 минуты смочите лишнюю жидкость.
   6. Чтобы снизить риск развития эндофтальмита, добавьте 1 каплю 5% бетадина на поверхность глаза и окружающие волосы. Оставить на глаз на 2-3 мин.<бр/> заметка: Выполняйте все процедуры, описанные в этом разделе, в соответствующих стерильных условиях для профилактики эндофтальмита.
   7. Удалите бетадин и покройте глаз гипромеллозой (0,3%) или карбомерным гелем для глаз 0,2% по мас., чтобы предотвратить сухость под анестезией. Это также поможет предотвратить образование катаракты.
2. Настройка системы микровпрыска
   1. Выполните интравитреальную инъекцию с помощью микронасоса, подключенного к контроллеру микрошприцевого насоса и инъекционному шприцу (рис. 1A-C). В качестве альтернативы можно ввести иглу 33 G, прикрепленную к шприцу Hamilton, как описано в подразделе 4.4.
   2. Подсоедините иглу 34 G к держателю для инъекций, чтобы собрать инжектор. Ослабьте серебряную винтовую крышку на переднем конце держателя для инъекций и вставьте иглу в корпус держателя примерно наполовину. Плотно затяните серебряный завинчивающийся палец.
   3. Подсоедините трубку к держателю для впрыска, как указано в шагах 4.2.4-4.2.5.
   4. Чтобы вставить трубку в держатель для впрыска, ослабьте пластиковый винт на заднем конце держателя, проденьте трубку через прокладку внутрь и затяните винт.
   5. Поддерживайте небольшой зазор с концом трубки, чтобы предотвратить повреждение трубки во время впрыска. Обратитесь к рисунку 1С.
   6. Разморозьте 100 мкл аликвоты бульонной суспензии микобактерий.
   7. Добавьте 3 мкл 1% раствора флуоресцеина натрия (AK-Fluor) и хорошо
   перемешайте.
   8. Загрузите в шприц объемом 10 мкл смесь антигена и флуоресцеина, не добавляя пузырьков воздуха.
   9. Извлеките загрузочную иглу из шприца и проденьте трубку через серебряную прокладку винтовой крышки до тех пор, пока наконечник не достигнет нулевой отметки в корпусе шприца.
   10. После того, как кончик трубки будет правильно выровнен в нужном положении, плотно затяните палец завинчивающейся крышки.
   11. Промывайте раствор в шприце через инъекционную трубку, чтобы полностью загрузить систему. Затем повторите шаги 4.2.8-4.2.11 для перезарядки шприца для инъекции.
   12. Чтобы установить заряженный шприц на микропомпу, нажмите кнопку разблокировки зажима на конце микропомпы, чтобы открыть зажимы шприца.
   13. Поместите колпачок поршня в держатель колпачка плунжера на заднем конце микронасоса.
   14. Затем наденьте хомут шприца на упор хомута и корпус шприца в зажим шприца.
   15. Отпустите кнопку зажима и затяните стопорный винт поршня. Обратитесь к рисунку 1D.
   16. Проденьте держатель инъекции и иглу через уплотнительный зажим на стереотаксическом аппарате для инъекций. Это кастомная платформа; Кроме того, шприц можно удерживать и позиционировать вручную.
   17. Установите объем инфузии и скорость объема инфузии на контроллере микрошприцевого насоса для впрыскивания 500 нл за цикл со скоростью 40 нл/с соответственно.
       заметка: Можно использовать более высокую скорость инъекций, однако может возникнуть больший рефлюкс, прежде чем будет достигнуто изменение положения иглы.
   18. Перед выполнением интравитреальной инъекции протестируйте систему на предмет ее правильного функционирования.
       заметка: Когда система впрыска функционирует правильно, активация цикла впрыска с помощью ножной педали или панели управления вызовет видимое движение держателя колпачка поршня, а на кончике иглы будет видна небольшая капля зеленоватой жидкости. В том случае, если жидкость не вырабатывается, активируйте дополнительные циклы или промойте и зарядите шприц заново.
   19. Перед введением глаза аккуратно протрите иглу подушечкой из 95% этанола.
3. Процедура интравитреального введения
   1. Мышь помещается на стереотаксический аппарат для выполнения процедуры инъекции.
   2. Держите сцену/платформу, на которой лежит мышь, в тепле, приложив к ее поверхности 2-3 бумажных полотенца.
   3. Поместите мышь в положение лежа на платформе. Используйте правую и левую ушные планки, чтобы аккуратно зафиксировать голову животного. Обратитесь к рисунку 1E.
   4. Расположите мышь и расположите ее под эндоскопом так, чтобы была видна верхняя носовая часть правого глаза.
   5. С помощью иглы 30 G сместите ресницы и обнажите склеру. Визуализируйте лимб и лучевой кровеносный сосуд.
   6. С помощью стерильной иглы 30 G сделайте направляющее отверстие в склере на 1-2 мм позади лимба.
   7. Вставьте иглу 34 G, прикрепленную к держателю для инъекций, в глаз через направляющее отверстие под углом, который позволит избежать линзы, но поместить кончик иглы в полость стекловидного тела.
   8. С помощью контроллера микрошприцевого насоса осторожно введите 1 мкл экстракта Mtb в полость стекловидного тела. В случае постоянного рефлюкса увеличьте объем инъекции до 1,5 мкл для обеспечения адекватной доставки дозы.
      заметка: Для фиктивного контроля введите 1 мкл PBS в глаз животного.
   9. Проверьте интравитреальное размещение путем визуализации зеленоватого рефлекса в глазу. Обратитесь к рисунку 1F.
   10. Через 10 с извлеките иглу из ушка. Обратите внимание на любой рефлюкс.
   11. Снимите мышь с платформы, нанесите 0,3% гипромеллозы или 0,2% мази для глаз с карбомером на оба глаза для защиты роговицы и переместите в коробку для восстановительного согревания.
   12. Не оставляйте мышь без присмотра до тех пор, пока она не придет в сознание, достаточное для поддержания лежачего положения на грудине. Не возвращайтесь в компанию других животных до полного выздоровления.
   13. Когда мышь полностью придет в себя, вернитесь в клетку и добавьте в нее ацетаминофен (200-300 мг/кг/день) лечебную бутылку с водой. Пометьте карточку кейджа датой инъекции ИВТ.
   14. Интравитреальные инъекции, как правило, хорошо переносятся. Клинические признаки, которые могут указывать на боль и необходимость удаления из исследования, включают периокулярную алопецию (свидетельствующую о самотравме), изъязвление роговицы, потерю веса и сгорбленную осанку.

Результаты

Рисунок 1: Установка интравитреальной инъекции у мыши. Интравитреальная инъекция выполняется в глаз мыши с использованием (A) контроллера микрошприцевого насоса, подключенного к (B) микронасосу и (C) инъекционного шприца. Шприц загружается и устанавливается на микронасос (D). Головка мыши расположена с помощью ушных планок (E...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
АК-ФЛЮОР	Акорн Фармасьютикалз, Иллинойс, США		10% флуоресцеин натрия 100 мг/мл во флаконе 5 мл
АнаСед	Akorn Animal Health, Иллинойс, США	НДЦ 59399-110-20	Ксилазин 20 мг/мл
Бетадин 5% стерильный офтальмологический раствор	Алкон, Техас, США	8007-1
B-D Иглы для прецизионного скольжения -25 г	Becton, Dickinson and Company, Нью-Джерси, США	305122
B-D Игла для прецизионного скольжения -30-G	Becton, Dickinson and Company, Нью-Джерси, США	305106
Bond MAX, Bond Rx	Leica Biosystems, Иллинойс, США		Автоматизированная система окрашивания ИГХ
Мазь с хлорамфениколом	Martindale Pharma, Ромфорд, Великобритания		1% с хлорамфениколом
EG1150H	Leica Biosystems, Иллинойс, США		Встраивание тканей
Энвису Р2300	Bioptigen/Leica		Аппарат ОКТ
Неполный адъювант Фройнда	BD Difco, Нью-Джерси, США	No 263910
GenTeal лубрикантная глазная мазь	Алкон, Техас, США	---
Гель для глаз GenTeal lubricant	Алкон, Техас, США	---
Экстракт лиофилизированных микобактерий H37Ra	BD Difco, Нью-Джерси, США	231141
Игла Hamilton RN (33/12/2)S	Гамильтон, Рино, Невада	7803-05(33/12/2)	33 Г
Шприц Гамильтона	Гамильтон, Рино, Невада	CAL7633-01	5 μл
Игла для инсулина	Exel International, США	No 26029	1 мл
Изофлуран
Кетасет	Зоэтис, США	377341	Кетамин гидрохлорид 100 мг/мл
Шприцевой насос для микроинъекций и контроллер Micro4Controller	World Precision Instruments, Флорида, США	УМП3
Микрон IV	Исследовательские лаборатории Феникса, Плезантон, Калифорния		Альтернативный аппарат визуализации/ОКТ
Шприц Nanofil 10 μL	World Precision Instruments, Флорида, США	НАНОФИЛ
Набор для интраокулярных инъекций Nanofil	World Precision Instruments, Флорида, США	IO-KIT
Olympus SZX10	Олимп		Объем диссекции
ПБС	Gibco	14190
Фенилэфрин гидрохлорид офтальмологический раствор USP 2,5% стерильный 15 мл	Акорн Фармасьютикалз, Иллинойс, США	17478020115
RM2255	Leica Biosystems, Иллинойс, США		Секционирование тканей
Шприц для туберкулеза	Becton, Dickinson and Company, Нью-Джерси, США	309602	1 мл
Тетракаин 0,5%	Алкон, Техас, США	1041544
Салфетки серии Tek VIP	Сакура Финетек США, Инк., Калифорния		Гистологическая обработка тканей
Тропикамид 1%	Chauvin Pharmaceuticals, Ромфорд, Великобритания		Минимы
Тайленол	Johnson & Johnson Consumer Inc, Пенсильвания, США	НДЦ 50580-614-01	Ацетаминофен
Вискозиеры	Novartis Pharmaceuticals, Кэмберли, Великобритания		Карбомерный гель для глаз 0,2% w/w