Приготовление и количественное определение посевного материала Mycobacterium bovis BCG lux для лечения инфекции

Аннотация

Источник: Asai, M. et al., Использование беспозвоночной Galleria mellonella в качестве модели инфекции для изучения комплекса Mycobacterium tuberculosis. J. Vis. Exp. (2019)

Это видео демонстрирует получение и количественное определение Mycobacterium bovis Bacillus Calmette-Guérin lux inoculum с использованием биолюминесцентного анализа и перечисления колониеобразующих единиц. Приготовленный инокулюм может быть использован для исследования инфекций.

Протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Все описанные ниже работы должны выполняться в лаборатории CL2 в микробиологическом шкафу безопасности класса 2 (MSC) в соответствии с местными рекомендациями по охране здоровья и безопасности.

1. Препарат M. bovis BCG lux при инфекции

1. Разморозьте замороженный 1,2 мл глицерина (15%) M. bovis BCG lux, монреальского вакцинного штамма, трансформированного с помощью челночной плазмиды pSMT1, несущей гены luxAB из Vibrio harveyi, кодирующие фермент люциферазу.
2. Инокулируйте 15 мл бульона Middlebrook 7H9, содержащего 0,2% глицерина, 10% альбумина, декстрозу, обогащение каталазой (АДХ) и 50 мкг/мл гигромицина размороженной 1,2 мл аликвоты БЦЖ люкс, в меченую колбу Эрленмейера объемом 250 мл.
3. Поместите колбу в герметичный контейнер биобезопасности и инкубируйте при температуре 37 °C в орбитальном вибрационном инкубаторе со скоростью 220 об/мин в течение 72 ч (или до тех пор, пока культура не достигнет средней фазы роста).
4. Проверьте рост культуры БЦЖ люкс, приготовив разведения культуры в соотношении 1:10 в люминометром с использованием фосфатно-солевого буфера (PBS, pH 7,4, 0,01 М фосфатного буфера, 0,0027 М хлорида калия и 0,137 М хлорида натрия) в двух экземплярах. Сделайте вихрь, загрузите трубки люминометра в люминометр и измерьте биолюминесценцию (относительная световая единица [RLU]/мл) с использованием n-децилальдегида в качестве подложки (1% v/v в абсолютном этаноле).
   заметка: Соотношение RLU/колониеобразующих единиц (КОЕ) ранее было определено как 3:1 при выращивании БЦЖ люкс in vitro в бульоне Middlebrook 7H9.
5. Центрифугируйте культуру при концентрации 2175 x g в течение 10 мин при комнатной температуре, чтобы гранулировать клетки и отбросить надосадочную жидкость в соответствующее дезинфицирующее средство с известной микобактерицидной активностью. Утилизируйте все отходы культуры дезинфицирующими средствами, подходящими для микобактерий, в соответствии с местными рекомендациями.
6. Дважды промойте клеточную гранулу в PBS, содержащем 0,05% полисорбата 80 (PBS-T), чтобы предотвратить образование бактериальных комков.
7. После окончательной промывки сцедите надосадочную жидкость отходов, ресуспендируйте клеточную гранулу микобактерий в PBS-T и разбавьте суспензию микобактерий до желаемой плотности клеток с помощью измерений RLU.
8. Готовьте десятикратные серийные разведения инокулюма в 24-луночных планшетах с помощью PBS-T. Выложите 10 мкл на агаровые пластины Middlebrook 7H11 (0,5% глицерина, 50 мкг/мл гигромицина, 10% олеиновой кислоты, альбумина, декстрозы, каталазы [OADC]) в двух экземплярах, чтобы подсчитать количество КОЕ инокулюма.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Реакционная пробирка 1,5 мл (Eppendorf)	Эппендорф	22431021
Пипетки объемом 20, 200 и 1000 мкл и отфильтрованные наконечники	Любой поставщик	н/д
24-луночный культуральный планшет	Грейнер	Номер 662160
Пипетки 25 мл и пипетка для мальчика	Любой поставщик	н/д
Чашка Петри с 3 отделениями (94/15 мм)	Грейнер	637102
центрифуга	Любой поставщик	н/д
Сафтейный шкаф класса II	Любой поставщик	н/д
Этанол (>99,7%)	ВВР	No 208221.321
глицерин	Сигма-Олдрич	Г5150
Гигромицин В	Корнинг	30-240КР
Люминомет (Autolumat LB 953)	Бертольд	34622 (Английский
Люминометры	Корнинг	352054
Микроцентрифуга	Любой поставщик	н/д
Миддлбрук 7H11 агар	BD Bioscience	No 283810
Бульон Миддлбрук 7H9	BD Bioscience	No 271310 (Английский
Обогащение АЦП Миддлбрука	BD Bioscience	212352
Обогащение OADC в Миддлбруке	BD Bioscience	No 212240
Mycobacterium bovis BCG lux	различный	н/д
N-децилальдегид	Сигма-Олдрич	Д7384-100Г
Орбитальный встряхивающий инкубатор	Любой поставщик	н/д
Фосфатно-солевой буфер	Сигма-Олдрич	П4417-100ТАБ
Полисорбат 80 (Твин-80)	Сигма-Олдрич	П8074-500мл
Колба Эрленмейера с вентилируемой крышкой (250 мл)	Корнинг	CLS40183
Winterm (версия 1.08)	Бертольд	н/д	Программа LB953.TTB