ПРИМЕЧАНИЕ: Все описанные ниже работы должны выполняться в лаборатории CL2 в микробиологическом шкафу безопасности класса 2 (MSC) в соответствии с местными рекомендациями по охране здоровья и безопасности.
1. Препарат M. bovis BCG lux при инфекции
- Разморозьте замороженный 1,2 мл глицерина (15%) микобактерии Bovis Bacillus Calmette-Guérin (BCG) lux, монреальского вакцинного штамма, преобразованного с помощью челночной плазмиды pSMT1, несущей гены luxAB от Vibrio harveyi, кодирующие фермент люциферазу.
- Инокулируйте 15 мл бульона Middlebrook 7H9, содержащего 0,2% глицерина, 10% альбумина, декстрозу, обогащение каталазой (АДХ) и 50 мкг/мл гигромицина размороженной 1,2 мл аликвоты БЦЖ люкс, в меченую колбу Эрленмейера объемом 250 мл.
- Поместите колбу в герметичный контейнер биобезопасности и инкубируйте при температуре 37 °C в орбитальном вибрационном инкубаторе со скоростью 220 об/мин в течение 72 ч (или до тех пор, пока культура не достигнет средней фазы роста).
- Проверьте рост культуры БЦЖ люкс, приготовив разведения культуры в соотношении 1:10 в люминометром с использованием фосфатно-солевого буфера (PBS, pH 7,4, 0,01 М фосфатного буфера, 0,0027 М хлорида калия и 0,137 М хлорида натрия) в двух экземплярах. Сделайте вихрь, загрузите трубки люминометра в люминометр и измерьте биолюминесценцию (относительная световая единица [RLU]/мл) с использованием n-децилальдегида в качестве подложки (1% v/v в абсолютном этаноле).
ПРИМЕЧАНИЕ: Соотношение RLU/колониеобразующих единиц (КОЕ) ранее было определено как 3:1 при выращивании BCG lux in vitro в бульоне Middlebrook 7H9.
- Центрифугируйте культуру при концентрации 2175 x g в течение 10 мин при комнатной температуре, чтобы гранулировать клетки и отбросить надосадочную жидкость в соответствующее дезинфицирующее средство с известной микобактерицидной активностью. Утилизируйте все отходы культуры дезинфицирующими средствами, подходящими для микобактерий, в соответствии с местными рекомендациями.
- Дважды промойте клеточную гранулу в PBS, содержащем 0,05% полисорбата 80 (PBS-T), чтобы предотвратить образование бактериальных комков.
- После окончательной промывки сцедите надосадочную жидкость отходов, ресуспендируйте клеточную гранулу микобактерий в PBS-T и разбавьте суспензию микобактерий до желаемой плотности клеток с помощью измерений RLU.
- Готовьте десятикратные серийные разведения инокулюма в 24-луночных планшетах с помощью PBS-T. Выложите 10 мкл на агаровые пластины Middlebrook 7H11 (0,5% глицерина, 50 мкг/мл гигромицина, 10% олеиновой кислоты, альбумина, декстрозы, каталазы [OADC]) в двух экземплярах, чтобы подсчитать количество КОЕ инокулюма.
2. Подготовка личинок G. mellonella
- Приобретайте личинки последнего возраста из соответствующих источников и поддерживайте личинки в темноте при температуре 18 °C по прибытии и используйте в течение 1 недели после покупки. В качестве альтернативы, личинки могут быть выращены самостоятельно в соответствии с протоколом Jojāo et al. Для приобретенных личинок выбросьте все мертвые, обесцвеченные или окукливающиеся личинки перед хранением.
ПРИМЕЧАНИЕ: Окукливающиеся личинки морфологически отличимы от личинок последнего возраста.
- Выявляйте и отбирайте здоровых личинок для экспериментов, основываясь на однородном кремовом цвете с незначительным обесцвечиванием (меланизацией) или без него, размере (2−3 см в длину), весе (примерно 250 мг), демонстрирующих высокий уровень подвижности и обладающих способностью выпрямляться при переворачивании.
- Тщательно пересчитайте здоровых личинок (минимум 20−30 в группе) в чашку Петри (94/15 мм), выстланную слоем фильтровальной бумаги (94/15 мм) с помощью пинцета с тупым концом, чтобы свести к минимуму загрязнение, и храните при комнатной температуре в темноте до использования.
3. Заражение G. mellonella БЦЖ люкс
- Сведите к минимуму беспорядок внутри MSC, чтобы снизить риск загрязнения и травм от уколов иглой.
- Подготовьте платформу для впрыска, приклеив круглую фильтровальную бумагу (94 мм) к плоской приподнятой поверхности. Можно использовать мягкие или твердые поверхности, которые полностью зависят от предпочтений пользователя, например, крышки от коробок для дозатора или нейлоновую губку для мытья посуды.
- Микрошприц объемом 25 мкл (25 г) простерилизовать путем отсасывания 3 объемов 70% этанола и далее промыть 3 объемами стерильного PBS-T.
- Аспирируйте 10 мкл инокулята БЦЖ люкс (приготовленного в разделе 1) или PBS-T в стерилизованный микрошприц объемом 25 мкл. Используйте отдельный шприц для отрицательного контроля PBS-T.
ПРИМЕЧАНИЕ: Суспендия БЦЖ люкс инокулюма после 10 инъекций для обеспечения равномерной суспензии клеток.
- С помощью пинцета возьмите одну личинку и поместите ее на платформу для инъекций.
- На платформе переверните личинку на спину и обездвижьте ее, закрепив голову и хвост пинцетом. Найдите последнюю левую ногу, отсчитывая вниз от головы личинки, и осторожно введите кончик иглы (5−6 мм) под углом 10−20° к горизонтальной плоскости. <бр/>
заметка: Короткий и узкий пинцет позволяет легко обездвижить его с минимальным личиночным стрессом. Обратите внимание на чрезмерное проникновение, которое может проколоть кишечник и вызвать меланизацию, специфичную для БЦЖ люкс, или смерть.
- Пересчитайте зараженных личинок в чашку Петри, выстланную слоем фильтровальной бумаги, одна чашка Петри диаметром 90 мм может вместить до 30 личинок.
- Храните чашку Петри, содержащую личинок, в вентилируемой или негерметичной темной коробке внутри инкубатора при температуре 37 °C с 5%CO2.
4. Мониторинг выживаемости G. mellonella после заражения
- С течением времени следите за выживаемостью личинок каждые 24 часа. Личинки считаются мертвыми, когда они не могут двигаться в ответ на прикосновение.
5. Измерение in vivo бремени БЦЖ люкс у G. mellonella
- В каждый момент времени случайным образом выберите пять зараженных личинок, предварительно подготовленных в разделе 3, и аккуратно простите, используя ватные палочки, смоченные в 70% этаноле. <бр/>
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг важен при осаждении гомогената личинок для перечисления микобактериальных КОЕ, поскольку нестерилизованные личинки могут привести к заражению.
- Поместите личинки по отдельности в пробирки лизирующей матрицы объемом 2 мл, содержащие 800 мкл стерильного PBS.
- Гомогенизировать личинок с помощью гомогенизатора в течение 60 с со скоростью 6,0 м/с.
- Центрифугируйте лизизационные пробирки при давлении 3 500 x g в течение 5 с, чтобы удалить гомогенат из крышек, и осторожно сцеживайте гомогенат в стерильные люминометры по отдельности><.
заметка: Для подсчета КОЕ (шаг 5.7) необходимо зарезервировать 100 мкл гомогената в стерильной реакционной пробирке объемом 1,5 мл.
- Восстановите оставшийся гомогенат, промыв пробирки с лизирующей матрицей 1 мл PBS-T и введя пипетку в соответствующие пробирки люминометра.
- Наведите вихревые трубки люминометра и измерьте биолюминесценцию гомогенатов, ранее описанных в шаге 1.4.
- Приготовьте десятикратное серийное разведение гомогената в 24-луночных культуральных планшетах с использованием PBS-T. Выложите 10 мкл разведенного раствора на агаровые планшеты Middlebrook 7H11, содержащие 0,5% глицерина, 50 мкг/мл гигромицина, 10% OADC и 20 мкг/мл пиперациллина, чтобы определить соотношение RLU/КОЕ БЦЖ люкс после инфекции in vivo.
ПРИМЕЧАНИЕ: Пиперациллин устраняет нативную микробиоту G. mellonella с минимальным ингибированием роста БЦЖ люкс.
