Мыши-мешочек для сбора липополисахарид-индуцированного воспалительного экссудата

Аннотация

Источник: Lu, Q., et al. Обнаружение миграции и инфильтрации нейтрофилов у мышей. J. Vis. Exp.(2020).

Это видео описывает процедуру создания воздушного мешочка в подкожной клетчатке мышей и сбора воспалительного экссудата в ответ на введение липополисахарида in vivo. В этом видео также представлен анализ инфильтрации нейтрофилов в воздушном мешочке.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.

1. Анализ воздушного мешка

1. Первый впрыск воздуха
   1. В день 0 полностью обезболить мышей 5% изофлураном в течение 3 мин в камере газовой анестезии со скоростью 2 л/мин и поддерживать анестезию каждой мыши в одном дыхательном аппарате 2% изофлураном со скоростью 0,5 л/мин.<бр/> заметка: Достаточная глубина анестезии обеспечивается за счет защемления пальцев ног перед перемещением мышей из камеры в одиночный дыхательный блок. Ноги не должны двигаться при защемлении пальцев ног.
   2. Используйте фильтр 0,22 мкм, прикрепленный к шприцу объемом 5 мл, чтобы получить объем стерилизованного воздуха объемом 3 мл.
   3. Поднимите заднюю кожу мыши, находящейся под наркозом, с помощью пинцета и подкожно введите 3 мл стерилизованного воздуха с помощью иглы размером 26 г x 3/8 дюйма.
   4. После обработки извлеките мышей из дыхательного аппарата. Следите за мышами, чтобы убедиться, что они живы, пока они не начнут двигаться.
2. Второй впрыск воздуха
   1. На 3-й день введите еще 3 мл стерилизованного воздуха в ранее созданный воздушный карман для поддержания воздушного мешка, как описано в разделе 1.1.
3. лечение
   1. На 6-й день, за 6 ч до жертвоприношения, введите в воздушный мешочек различные препараты. Введите 1 мл фосфатно-солевого буфера (PBS) в качестве отрицательного контроля. Введите 1 мл 1 мкг/мл ЛПС в качестве положительного контроля, чтобы вызвать местное воспаление.
   2. Полностью обезболить мышей 5% изофлураном в течение 3 мин в камере газовой анестезии со скоростью 2 л/мин и поддерживать анестезию каждой мыши в одном дыхательном аппарате 2% изофлураном со скоростью 0,5 л/мин. Подготовить промывочный буфер в соответствии с таблицей материалов.
      заметка: Достаточная глубина анестезии обеспечивается за счет защемления пальцев ног перед перемещением мышей из камеры в одиночный дыхательный блок. Ноги не должны двигаться при защемлении пальцев ног.
   3. Для каждого воздушного мешочка промойте его 1 мл промывочного буфера и соберите воспалительный экссудат в центрифужную пробирку объемом 15 мл. Промойте воздушный мешочек 2 мл буфера для промывки 2x и соберите воспалительный экссудат в той же центрифужной пробирке.
   4. Центрифугируйте при 100 x g в течение 10 мин при RT. Выбросьте надосадочную жидкость и ресуспендируйте клетки в 1 мл промывочного буфера. Подсчитайте количество клеток для количественного определения соотношения нейтрофилов с помощью автоматического гематологического анализатора.
      заметка: Репрезентативные результаты показаны на рисунке 1.

Результаты

Рисунок 1: Репрезентативные результаты анализа с помощью воздушного мешка. (A) Иллюстрация анализа с помощью воздушного мешка. (B) Репрезентативные результаты инфильтрации подмножества лейкоцитов в анализе из воздушного мешка. PBS: контроль; ЛПС: 1 мкг/мл ЛПС. Данные представлены в виде среднего ± SD.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
100% этанол	Пекинский химический завод
100% метанол	Пекинский химический завод
Коническая полипропиленовая центрифужная трубка 15 мл	сокол	сокол
Игла 23 Г x 1 1/4 дюйма	БД	305120 (Английский
Игла 26 г x 3/8 дюйма	БД	305110 (Английский
Игла 30 г x 1/2 дюйма	БД	305106
Шприц 5 мл	БД	Z683574
Коническая полипропиленовая центрифужная трубка 50 мл	сокол	Телефонный номер 14-432-22
Система газовой анестезии	ЗС Дичуан	ЗС-МВ-IV
Фосфатно-солевой буфер (PBS), 1×			Смешайте 90% ddH2O с 10% (v/v) 10×PBS, автоклавный
Фосфатно-солевой буфер (PBS), 10×			Растворить 16 г NaCl, 0,4 г KCl, 2,88 г Na2HPO4·2H2O, 0,48 г KH2PO4 (безводный) в 200 мл ddH2O, отрегулировать pH 7,4, автоклавировать
Липополисахарид (ЛПС)	сигма	Л3012
Промывочный буфер в воздушном мешке			Разбавьте 0,5М ЭДТА до 10 мМ с помощью HBSS

) )