$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Подготовка катетеров
- Приготовьте одну педиатрическую канюлю внутривенного доступа для каждой группы инфицированных мышей. С помощью встроенного пружинного механизма извлеките из каждой канюли ее иглу, как указано производителем. Выбросьте иглы, сохранив только пластиковую канюлю для внутривенного введения.
- Стерилизуйте катетеры в колпаке с ламинарным потоком в течение одного цикла ультрафиолета (УФ), обычно 25 - 30 мин.<бр/>
Примечание: Катетеры можно использовать для более чем одной мыши, однако новый катетер следует использовать между экспериментальными группами, полами или бактериальными штаммами.
2. Подготовка уропатогенной кишечной палочки к инфекции
- Не менее чем за два дня до заражения, используя стерильную петлю инокуляции, нанесите UPEC из замороженного бактериального бульона на агаровую тарелку Luria Broth (LB), содержащую антибиотики, если это необходимо. Инкубировать при температуре 37 °C в течение ночи. Тарелки можно хранить при температуре 4 °C до одной недели.
- В стерильную колбу Эрленмейера объемом 100 мл введите 10 мл LB, содержащую антибиотики, если это необходимо, одну колонию из планшета LB и инкубируйте при температуре 37 °C в течение ночи (примерно 16 - 18 часов).
Примечание: Стоячие культуры позволяют экспрессировать пили типа 1, которые необходимы для инфекции. Культуры, выращенные при встряхивании, будут иметь менее эффективную экспрессию пили и, следовательно, непостоянную скорость заражения.
- Измерьте оптическую плотность (OD)600 ночной культуры и рассчитайте количество бактерий на мл с помощью заранее определенной кривой роста. Например, для штамма UTI89 UPEC600 = 0,35 эквивалентен 2 x 108 КОЕ на мл, таким образом, культура за ночь с OD600 = 2,4 будет эквивалентна 13,7 x 108 КОЕ на мл. Опытным путем определить взаимосвязь между OD600 и жизнеспособными бактериями с каждым новым штаммом, используемым для инфекции.
- Определите необходимое количество бактерий, учитывая количество животных, подлежащих заражению, и то, что каждая мышь должна получать примерно 107 колониеобразующих единиц (КОЕ) в 50 μл PBS. Включите в расчет ~130 мкл мертвого объема катетера и шприца и 100 мкл, необходимых для определения инокулюма.
- Вращайте бактериальную суспензию в настольной микроцентрифуге при давлении 17 000 x g в течение 1 минуты и повторно суспендируйте полученную бактериальную гранулу при концентрации 2 x 108 КОЕ на мл в PBS. Последовательно разбавляйте аликвоту этой суспензии и наносите ее на LB-агар, при необходимости с антибиотиками, чтобы определить точный инокулюм для каждой инфекции.
- Наберите бактериальный инокулюм в шприц объемом 1 мл и прикрепите катетер к концу шприца. Постучав по шприцу, удалите воздух, и нажмите на поршень, чтобы заполнить мертвое воздушное пространство в катетере перед началом инстилляции.
3. Подготовка мышей
- Обезболивайте мышей путем внутрибрюшинного введения 100 мг/кг кетамина и 5 мг/кг ксилазина. Может быть предоставлено дополнительное отопление.
- Убедитесь, что каждая мышь полностью усыплена, сдавливая подушечку лапы со средним давлением. Мыши полностью усыпляются, когда они не реагируют, и им требуется 3 - 5 минут, чтобы достичь этого состояния.
- Положите мышей в положение лежа на спине и надавите на нижнюю часть живота, чтобы опорожнить мочевой пузырь от мочи. Полные мочевые пузыри ощущаются как горошины под кожей между гребнями подвздошной кости.
Примечание: Ингаляционный изофлуран использовался для катетеризации самок мышей, однако не было проверено, достаточно ли самцы мышей обезболены ингаляционным изофлураном для этой процедуры.
4. Трансуретральная инстилляция самцов мышей
- Поместите два щипца большого пальца краниально и каудально к наружным половым органам мыши. Втяните препуций, чтобы полностью обнажить головку полового члена. Как только пенис будет расположен снаружи, отпустите щипцы для большого пальца.
- Переместите щипцы так, чтобы стабилизировать выступающий пенис перпендикулярно животному, удерживая орган мягко, но туго. Визуализируйте проход уретры и осторожно введите катетер в небольшое отверстие на кончике органа. Осторожно введите катетер в половой член, по направлению к телу мыши, поддерживая мягкое натяжение щипцами. Катетер не требует смазки. Не вводите катетер с силой в половой член; Катетер должен плавно скользить в мочеиспускательный канал, указывая на правильное размещение.
- Как только ступица катетера встретится с кончиком полового члена, очень медленно выведите 50 мкл инокулюма, сохраняя при этом положение полового члена. Качество инстилляции можно отметить в это время в соответствии с заранее определенной оценкой качества инстилляции, как показано на рисунке 1.
- Медленно втяните катетер, на счет 5, чтобы предотвратить утечку инокулюма. Поместите мышей в их клетки в положение лежа на спине. Животные должны начать восстанавливаться через 30 - 45 минут после введения анестетика.
