Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Подготовка катетеров
- Приготовьте одну педиатрическую канюлю внутривенного доступа для каждой группы инфицированных мышей. С помощью встроенного пружинного механизма извлеките из каждой канюли ее иглу, как указано производителем. Выбросьте иглы, сохранив только пластиковую канюлю для внутривенного введения.
- Стерилизуйте катетеры в колпаке с ламинарным потоком в течение одного цикла ультрафиолета (УФ), обычно 25 - 30 мин.<бр/>
заметка: Катетеры могут использоваться более чем для одной мыши, однако новый катетер должен использоваться между экспериментальными группами, полами или бактериальными штаммами.
2. Подготовка уропатогенной кишечной палочки к инфекции
- Не менее чем за два дня до заражения, используя стерильную петлю инокуляции, выведите уропатогенную кишечную палочку (UPEC) из замороженного бактериального бульона на агаровую пластину Luria Broth (LB), содержащую антибиотики, если это необходимо. Инкубировать при температуре 37 °C в течение ночи. Тарелки можно хранить при температуре 4 °C до одной недели.
- В стерильную колбу Эрленмейера объемом 100 мл введите 10 мл LB, содержащую антибиотики, если это необходимо, одну колонию из планшета LB и инкубируйте при температуре 37 °C в течение ночи (примерно 16 - 18 часов).
заметка: Стоячие культуры позволяют экспрессировать пили 1 типа, которые необходимы для инфекции. Культуры, выращенные при встряхивании, будут иметь менее эффективную экспрессию пили и, следовательно, непостоянную скорость заражения.
- Измерьте оптическую плотность (OD)600 ночной культуры и рассчитайте количество бактерий на мл с помощью заранее определенной кривой роста. Например, для штамма UTI89 UPEC600 = 0,35 эквивалентен 2 x 108 колониеобразующей единице (КОЕ) на мл, таким образом, ночная культура с OD600 = 2,4 будет эквивалентна 13,7 x 108 КОЕ на мл. Опытным путем определить взаимосвязь между OD600 и жизнеспособными бактериями с каждым новым штаммом, используемым для инфекции.
- Определите необходимое количество бактерий, учитывая количество животных, подлежащих заражению, и то, что каждая мышь должна получать примерно10-7 колониеобразующих единиц (КОЕ) в 50 мкл фосфатно-солевого буфера (PBS). Включите в расчет ~130 мкл мертвого объема катетера и шприца и 100 мкл, необходимых для определения инокулюма.
- Вращайте бактериальную суспензию в настольной микроцентрифуге при давлении 17 000 x g в течение 1 минуты и повторно суспендируйте полученную бактериальную гранулу при концентрации 2 x 108 КОЕ на мл в PBS. Последовательно разбавляйте аликвоту этой суспензии и наносите ее на LB-агар, при необходимости с антибиотиками, чтобы определить точный инокулюм для каждой инфекции.
- Наберите бактериальный инокулюм в шприц объемом 1 мл и прикрепите катетер к концу шприца. Постучав по шприцу, удалите воздух, и нажмите на поршень, чтобы заполнить мертвое воздушное пространство в катетере перед началом инстилляции.
3. Подготовка мышей
- Обезболивайте мышей путем внутрибрюшинного введения 100 мг/кг кетамина и 5 мг/кг ксилазина. Может быть предоставлено дополнительное отопление.
- Убедитесь, что каждая мышь полностью усыплена, сдавливая подушечку лапы со средним давлением. Мыши полностью усыпляются, когда они не реагируют, и им требуется 3 - 5 минут, чтобы достичь этого состояния.
- Положите мышей в положение лежа на спине и надавите на нижнюю часть живота, чтобы опорожнить мочевой пузырь от мочи. Полные мочевые пузыри ощущаются как горошины под кожей между гребнями подвздошной кости.
заметка: Ингаляционный изофлуран использовался для катетеризации самок мышей, однако не было проверено, достаточно ли самцы мышей обезболиваются ингаляционным изофлураном для этой процедуры.
4. Трансуретральная инстилляция самок мышей
- Используя недоминирующую руку, поместите большой палец на хвост, а палец той же руки на живот мыши и слегка надавите в противоположных направлениях, чтобы надежно удерживать мышь на месте.
- Поместите кончик катетера перпендикулярно мыши в уретральное отверстие. С легким нажимом вставьте катетер в уретру, пока ступица не встретится с отверстием уретры, одновременно опуская шприц так, чтобы он был параллелен рабочей поверхности. Катетер не требует смазки. Не проталкивайте и не вводите катетер с силой в мочеиспускательный канал. Катетер должен плавно и легко скользить в уретру с минимальным сопротивлением или без него.
- Перед введением инокулюма (шаг 4.3), как только катетер будет на месте, очень осторожно потяните кожу живота по направлению к голове мыши пальцем из недоминантной руки, которая уже находится на животе мыши (шаг 4.1). Если катетер находится в уретре, ткань, составляющая отверстие уретры, не будет двигаться, в то время как если катетер неправильно размещен во влагалище, ткань будет двигаться вверх и в сторону от катетера. Этот экспресс-тест должен быть выполнен на каждой мыши.
- Когда ступица катетера встретится с отверстием уретры, медленно введите 50 мкл бактериального посева. Медленная скорость инстилляции сводит к минимуму пузырно-мочеточниковый рефлюкс в почку. Медленно извлеките катетер, чтобы предотвратить утечку, на счет 5. Поместите мышей в их клетки в положение лежа на спине.
