$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Все процедуры, связанные с животными моделями, были рассмотрены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Проточный цитометрический анализ ткани мочевого пузыря
- Приготовьте буфер для расщепления, содержащий коллагеназу в концентрации 34 ед/мл и ДНКазу в концентрации 100 г/мл в PBS. Держите на льду. Подготовьте одну коническую пробирку объемом 15 мл на каждое животное для анализа и добавьте 1 мл буфера для разложения на каждую пробирку.
- В заранее определенные моменты времени приносите мышей в жертву, используя утвержденные стандартные операционные процедуры (например, при вывихе шейки матки или передозировке углекислого газа). Тщательно смочите брюшную полость 70% этанолом, чтобы свести к минимуму загрязнение шерстью.
- Сделайте разрез через нижнюю треть брюшка мыши не менее 2 см с помощью ножниц и удалите весь мочевой пузырь. Хорошо пропустите через мясорубку ножницами, разрезав мочевой пузырь на 2 части размером2 мм, обычно около 8 штук.
- Добавьте по одному измельченному пузырю в каждую трубку, содержащую буфер для пищеварения. Встряхните, чтобы смыть измельченную ткань мочевого пузыря в буфер для пищеварения. Держите на льду, пока все пузыри не будут рассечены и измельчены.
- Инкубировать измельченные пузыри в течение 60 - 75 минут при температуре 37 °C, энергично встряхивая вручную в течение 5 с каждые 15 минут. Когда ткань имеет стекловидный прозрачный вид, напоминающий влажную папиросную бумагу, пищеварение завершено. Длительное пищеварение удаляет поверхностные белки из клеток, необходимых для идентификации, и его следует избегать.
- Инактивируйте ферменты пищеварения, добавив 2 - 3 мл ледяного проточного цитометрического буфера (PBS, содержащий 2% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 0,2 мМ ЭДТА) и осторожно перемешайте. Поместите трубки на лед.
- Чтобы обеспечить одноклеточную суспензию и удалить любую соединительную ткань, пропустите содержимое пробирки через фильтр 100 мкм, помещенный в коническую пробирку объемом 15 мл. Аккуратно продавите остатки ткани через фильтр концом поршня шприца. Промойте фильтр дополнительным буфером для проточной цитометрии объемом 2 мл. Храните образцы на льду.
- Промыть образцы центрифугированием в течение 7 мин при 200 x g, 4 °C. Суспендировать гранулы в буфере проточной цитометрии объемом 100 мкл, содержащем блок Fc, разбавленном до 5 мкг/мл, и перенести в 96-луночный круглый нижний планшет. Через 10 - 15 минут добавьте 100 мкл желаемого коктейля антител в каждый образец. Инкубировать образцы в течение 30 - 45 мин, на льду, защищенном от света.
заметка: Fc-блок — это реагент, используемый для предотвращения связывания Fc-части антител с клетками, экспрессирующими Fc-рецепторы. Его цель — свести к минимуму связывание неспецифических антител. Определение используемых антител будет зависеть от гипотезы, проверяемой в эксперименте, и должно быть выбрано с учетом литературных данных. На рисунке 1 для измерения общей инфильтрации иммунных клеток было использовано антитело против CD45, которое представляет собой паниммунный клеточный белок.
- Промывайте образцы центрифугированием в течение 7 мин при 200 x g, 4 °C. Ресуспендируйте клеточные гранулы в буфере проточной цитометрии объемом 200 мкл и пропускайте образцы через клеточное сетчатое фильтр 40 мкм на полистирольной пробирке объемом 5 мл непосредственно перед получением на проточном цитометре.
- Соберите весь образец на проточном цитометре. Хорошее пищеварение дает 200 000 - 400 000 клеток, из которых 8 000 - 10 000 CD45+ иммунных клеток из наивных мышиных пузырей, в то время как инфицированные органы будут содержать больше клеток (рис. 1><).
заметка: Образцы, подготовленные для проточного цитометрического анализа, не могут быть использованы для оценки КОЕ. Не рекомендуется разделять мочевой пузырь на две части, так как нет никаких доказательств того, что колонизация уропатогенной кишечной палочкой (UPEC) или инфильтрация иммунных клеток равномерны по всей ткани.
