Способ создания модели бактериальной инфекции в культуре органов ex vivo

Аннотация

Источник: Rizzuto, G. A., et al. Культуры плацентарных и децидуальных органов человека для изучения инфекций на границе между матерью и плодом. J. Vis. Exp. (2016)

Это видео демонстрирует метод создания модели инфекции в тканях плаценты для изучения распространения инфекции. Культура плацентарных органов ex vivo инфицирована Listeria monocytogenes, факультативным внутриклеточным паразитом. Бактерии проникают в экстраворсинчатые трофобласты (ЭВТ), проникают в плацентарную ткань, а затем размножаются в другие клетки путем межклеточного распространения.

Протокол

Все процедуры с участием людей были выполнены в соответствии с институциональными, национальными и международными рекомендациями по благополучию человека и были рассмотрены местным институциональным наблюдательным советом.

1. Подготовка планшетов для культивирования органов

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги должны быть выполнены с использованием стерильной техники в капюшоне для культуры тканей. Он идеально подходит для того, чтобы препарирующий микроскоп находился в стерильном поле. Тем не менее, это не является абсолютно необходимым, если микродиссекция выполняется быстро, а инструменты часто погружаются в 70% этанол.

1. Разморозьте флакон (флаконы) с внеклеточным матриксом (ВКМ) на льду. Разбавьте ECM 1:1 ледяной средой для сбора и перемешайте с помощью пипетирования. Делайте пипетку медленно, чтобы избежать образования пузырьков. Каждая лунка 6-луночного тканевого планшета требует 100 мкл этой суспензии и вмещает 3-4 культуры органов.
2. Поместите трансвелловые вставки (размер пор 0,4 мкМ) в каждую лунку 6-луночного тканевого планшета.
3. Покройте каждую вставку Transwell тонким слоем (100 μл) суспензии ECM/среды.
4. Поставьте пластину на лед и сразу приступайте к установлению органных культур. В качестве альтернативы подготовьте пластину перед сбором ткани, в этом случае оберните ее парапленкой и храните при температуре 4 °C для последующего использования. Хранение дольше 6 часов не рекомендуется, так как ECM высыхает.

2. Создание органных культур

>ПРИМЕЧАНИЕ: На этом шаге описывается, как разместить культуры децидуальных органов и ворсинчатые культуры органов в отдельных трансвеллах. Ткани не соприкасаются. Исследователи, заинтересованные в технике совместного культивирования, в которой децидуа и ворсинки находятся в прямом контакте друг с другом, могут обратиться к предшествующей литературе.

1. Дважды промойте образцы в среде для сбора и центрифугируйте при давлении 1 000 x g между каждым промывкой. Перенесите ткань в стерильную чашку Петри и поместите ее на столик препарирующего микроскопа. Держите 6-луночный планшет на льду рядом с микроскопом.
2. Микрофрагментация тканей с помощью стерильных ножниц и щипцов для рассечения шпрингеров для создания культур ворсинчатых органов размером 2-3 мм (рис. 1A).
   заметка: Культуры ворсинчатых органов представляют собой небольшие, хорошо васкуляризированные «деревья» с 2 или 3 ветвями и с выступающими столбиками клеток экстраворсинчатого трофобласта (EVT). Важно использовать только ворсинчатую ткань из образцов <9 недели первого триместра, так как инвазия экстраворсинчатых трофобластов в ВКМ наиболее выражена в этом молодом возрасте.
3. Выберите хорошо васкуляризированные ворсинки с выступающими столбиками клеток EVT. Столбцы ячеек EVT визуализируются в виде выпуклых, «нечетких», «пушистых» концов (см. стрелки на рисунке 1А).
4. С помощью стерильных щипцов перенесите 3 или 4 ворсинчатых дерева в каждый трансвелл. Отрегулируйте ветви так, чтобы дерево располагалось ровно на вершине ECM, и отделите сгруппированные ветви.
5. Микродиссекция децидуальной ткани стерильными ножницами и щипцами для получения 3 мм 3 культур децидуальных органов (рис. 1A).
   заметка: Образцы содержат два различных типа децидуальных тканей: decidua parietalis и decidua capsularis (фрагменты левой и правой ткани соответственно, рис. 1A).
6. Обрежьте ножницами до создания^{3 мм 3} штуки децидуа теменная. Decidua capsularis для этих культур не используется. Используйте щипцы, чтобы удалить свернувшуюся материнскую кровь.
7. С помощью стерильных щипцов перенесите по 3-4 кусочка децидуала в каждый трансвелл.
8. Добавьте на дно лунки 1 мл фильтрующего материала Collection. Инкубируйте планшет в течение ночи при 37 °C и 5%_CO2.
9. Для экспериментов, в которых важно имитировать нормальное напряжение кислорода в плаценте в первом триместре, поддерживайте культуру ворсинчатых органов в условиях относительной гипоксии (3%_О2).
   заметка: Лабораторные варианты включают небольшие камеры инкубатора с гипоксией, которые помещаются внутри существующих инкубаторов, или тригазовый инкубатор, который вводит внешний газ_N2 для снижения концентрации кислорода.
10. Добавьте 1 мл ворсинчатой или децидуальной среды (Таблица 1) в верхнюю часть транслунга через 12-16 часов посева.
    заметка: Отсутствие среды в течение первой ночи в культуре позволяет экстраворсинчатым клеточным колонкам трофобласта проникнуть (ворсинчатая культура) и надежно внедрить ткань (как ворсинчатую, так и децидуальную) в ВКМ. По нашему опыту, культуры цидуальных органов остаются жизнеспособными в течение 72 часов, а культуры ворсинчатых органов — в течение 96 часов. Мы рекомендуем экспериментальные конечные точки, которые попадают в эти временные рамки. Состав ворсинчатой и децидуальной среды см. в таблице 1. Ворсинчатая среда имеет высокий процент FBS, в то время как децидуальная среда дополнена гормонами беременности (прогестерон, 17β-эстрадиол), которые поддерживают децидуализированное состояние (табл. 1).

3. Получение культур L. monocytogenes

ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения подробной информации о долгосрочном хранении L. monocytogenes, а также о культивировании и росте этого микроорганизма в бульоне и агаре для инфузии сердца (BHI), пожалуйста, обратитесь к Wang et al.

1. Выберите одну колонию L. monocytogenes из прожилочной агаровой пластины BHI и введите 3 мл бульона BHI.
2. Инкубировать культуру L. monocytogenes в течение ночи (16 часов) в наклонном положении при температуре 30 °C.
   заметка: Эти условия культивирования позволяют росту бактерий достичь стационарной фазы. L. monocytogenes подвергается жгутикованию при 30 °C, что увеличивает инвазию клеток-хозяев.

4. Инфицирование культур органов L. monocytogenes

1. Подогреть фосфатно-солевой буфер (PBS) и ворсинчатую или децидуальную среду (табл. 1) до 37 °C.
2. Используйте стерильный пинцет для удаления любых фрагментов культуры органов, которые не проникли в ВКМ и, следовательно, плавают в лунке.
3. Осторожно отсасывайте среду со дна трансвелла. Дважды промойте верхние и нижние транслунлы, аккуратно пипетируя 1 мл теплого PBS в лунку и осторожно отсасывая между ними. Аккуратно внесите пипеткой 1 мл ворсинчатой или децидуальной среды, не содержащей антибиотиков, в верхний и нижний трансвелл. Будьте осторожны, чтобы не нарушить культуру органов.
4. Дайте ткани инкубироваться в среде, не содержащей антибиотиков, в течение как минимум часа, чтобы убедиться, что антибиотики были удалены.
   заметка: В стационарной фазе плотность культуры L. monocytogenes составляет примерно 1 х^{10 9} колониеобразующих единиц (КОЕ) на мл. Количество бактерий, используемых для заражения культур органов, должно быть определено эмпирически для удовлетворения экспериментальных потребностей.
5. Для L. monocytogenes дикого типа рутинные эксперименты с инфекцией показывают устойчивую инвазию с разведением в соотношении 1:50 в течение ночи (4 x 10,⁷ L. monocytogenes в 1 мл среды на лунку). Ресуспендируйте соответствующее количество бактерий в ворсинчатой или децидуальной среде, не содержащей антибиотиков.
6. Аспирируйте среду из верхней части трансвеллов. Аккуратно добавьте 1 мл посевного материала. Инкубируйте планшеты при 37 °C с 5%_CO2, чтобы обеспечить бактериальную инвазию.
7. Удаляйте внеклеточные бактерии путем аспирации среды из верхних и нижних трансвеллов. Дважды промойте лунки теплым PBS. Добавьте по 1 мл ворсинчатой или децидуальной среды с добавлением 50 мкг ^мл-1 гентамицина. Инкубируйте планшеты при 37 °C в 5% CO₂,
   Примечание: L. monocytogenes является факультативной внутриклеточной бактерией, которая может расти во внеклеточной среде, расти внутри клеток и распространяться от клетки к клетке, не получая доступа к внеклеточному пространству. Гентамицин оказывает бактерицидное действие на внеклеточные L. monocytogenes и, таким образом, позволяет измерять внутриклеточный рост L. monocytogenes и его распространение по органной культуре.
   заметка: Воспроизводимое инфицирование L. monocytogenes культур ворсинчатых и децидуальных органов происходит с 5-часовой инкубационной периодичностью. Время инкубации до добавления гентамицина может быть изменено в зависимости от экспериментальных потребностей и способности организма проникать в ткани. Чтобы лучше понять анатомические участки, наиболее уязвимые к инфекции, можно использовать более короткое время инкубации.
8. Поддерживайте температуру в планшетах при 37 °C и 5%_CO2 в течение всего эксперимента. Ежедневно меняйте весь фильтрующий материал в каждой лунке.
   заметка: По нашему опыту, культуры децидуальных органов, инфицированные L. monocytogenes, остаются жизнеспособными в течение 48 часов, а культуры ворсинчатых органов — в течение 72 часов.

Таблица 1: Медиа-рецепты. Компоненты и концентрации для приготовления промывочного буфера, сборной среды, ворсинчатой среды и децидуальной среды

Буфер для промывки	Среда для сбора	Ворсинчатая среда	Децидуальная среда
ПБС	DMEM/F-12 с GlutaMAX	DMEM/F-12 с GlutaMAX	DMEM/F-12 с GlutaMAX
Пенициллин 100 МЕ/мл	Фетальная бычья сыворотка 2,5%	Фетальная бычья сыворотка 20%	Фетальная бычья сыворотка 2,5%
Стрептомицин 100 мкг/мл	Пенициллин 100 МЕ/мл	Пенициллин 100 МЕ/мл	17β-эстрадиол 300 пг/мл
Гентамицин 50 мкг/мл	Стрептомицин 100 мкг/мл	Стрептомицин 100 мкг/мл	Прогестерон 20 нг/мл
Амфотерицин В 1,25 мкг/мл	Гентамицин 50 мкг/мл
	Амфотерицин В 1,25 мкг/мл

Результаты

Рисунок 1: Ворсинчатые культуры органов – Репрезентативные грубые и микроскопические изображения.

(A) Два терминальных ворсинчатых дерева с гестационным возрастом 6 недель, если смотреть под микроскопом. Обратите внимание на «пушистые» концы (наконечники стрел) и выступающую сосудистую сеть плода, проходящую через ветви дерева слева, что д...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Стерилизационные пакеты	Научный центр Фишера	Тел.: 01-812-54	Для автоклавирования отдельных рассекающих инструментов
Мелкоячеистое ситечко	Куизинар (Amazon.com)	NA	Перед сбором салфетки полностью оберните в алюминиевую фольгу и проведите автоклав.
Карбой с патрубком	Научный центр Фишера	03-007-647 (Английский	Для больших объемов готовится буфер для промывки.
Со льдом	Лаборатории Nortech	ГБ8818	Их не обязательно покупать, их можно переработать/повторно использовать из любой обычной лабораторной поставки, которая включает их в упаковку.
70% этанол	ВВР	В1001	70% раствор получен путем добавления dH20 к 190 или 200 пробному спирту исследовательского качества.
10% отбеливатель	Восковые санитарные принадлежности	КЛО 30966	10% раствор получается путем добавления dH20.
Световой короб	Лайтбокс Lumina (dickblick.com)	55305-2009	Обратите внимание на сменные лампы, также приобретенные на Blick (55305.0100)
Микрорассекающие щипцы	Стоелтинг	52102-43	4 дюйма, 1x2 0,5 мм, небольшой изгиб
Микрорассекающие щипцы	Стоелтинг	52102-06	4 дюйма, прямой тонкий, острый
Пружинные ножницы для микрорассечения ванн	Стоелтинг	52130-01П	Пружинные ножницы McPherson-Vannas, 8,5 см, наконечник 0,33, небольшой изгиб
Препарирующий микроскоп	Leica Microsystems	MZ16 или M60	У нас был успех с перечисленными моделями. Внешние гибкие источники света на гусиной шее полезны, но не обязательны.
Конические пробирки объемом 50 мл	Сигма-Олдрич (Corning)	CLS4558
Фосфатно-солевой буфер	Gibco (ThermoFisher Scientific)	10010023	Мы покупаем продукцию в нашем университетском центре Tissue Culture Core, доступны альтернативные варианты, подобные этому.
10X Фосфатный буферный раствор	Текнова	П0195	Для приготовления промывочного буфера мы используем 10X PBS
Питательная смесь DMEM/F-12 (Ham's) с GlutaMAX	Gibco (Life Technologies)	10565-018	Мы приобретаем эту специфическую среду, содержащую 2,438 г/л бикарбоната натрия, 55 мг/л пирувата натрия и 4,5 г/л глюкозы
Гентамицин	Thermofisher Scientific	15710072	Сток 1000X. Рекомендуется готовить и хранить аликвоты при температуре -20 °C во избежание замерзания/оттаивания.
Пенициллин/стрептомицин	Gibco (ThermoFisher Scientific)	15140-122	100X стоковый. Рекомендуется готовить и хранить аликвоты при температуре -20 °C во избежание замерзания/оттаивания.
Амфотерицин В	Gibco (ThermoFisher Scientific)	15290-018	Стоковый 500X. Рекомендуется готовить и хранить аликвоты при температуре -20 °C во избежание замерзания/оттаивания.
Прогестерона	Сигма-Олдрич	П8783	Стоковый раствор с концентрацией 1 мМ получают путем восстановления 15,7 мг порошка прогестерона в 15,7 мл этанола и добавления 34,3 мл PBS. Раствор стерильно фильтруют, аликвотируют и хранят при температуре -20 °C.
17β-эстрадиол	Сигма-Олдрич	Е2758	Стоковый раствор 10 мкМ получают путем восстановления 13,5 мг порошка эстрадиола в 10 мл этанола и добавления 40 мл PBS. Раствор стерильно фильтруют, аликвотируют и хранят при температуре -20 °C.
Вакуумный фильтр для бутылки (0,22 мкм)	Сигма-Олдрич (Corning)	CLS430769	Для стерильной фильтрации коллекционных сред после подготовки
6-луночный планшет для культивирования тканей	BD Falcon	353224	Полистирол, обработанный культурой тканей
6-луночные трансвеллы	Многородность	PICM03050	Вставка - диаметр 30 мм, размер пор 0,4 мкм, гидрофильная мембрана из фторопласта
Внеклеточный матрикс (например, матрикс Матригель)	BD Biosciences	354234	В наших исследованиях мы использовали матрицу Матригеля. Это твердое вещество при комнатной температуре и при -20 °C. Избегайте повторного замораживания/размораживания. Разморозьте флакон до вязкого раствора при 4 °C и приготовьте ~300 мкл аликвот в холодном помещении с охлажденными наконечниками для пипеток. Хранить аликвоты при температуре -20 °C.
Параформальдегид, 16% мас.% водного раствора	Альфа Аэсар	30525-89-4 (Английский)	Для фиксации тканей изготавливают свежий препарат из 4% параформальдегида путем разведения этого запаса в PBS.
Инкубатор для культивирования тканей, поддерживаемый при температуре 37 °C, 5%CO2, 3% кислорода (необязательно для культур ворсинчатых органов)			Для некоторых экспериментов может быть предпочтительна гипоксия. Это может быть установлено несколькими способами, включая добавление экзогенного азота через газовый баллон, трубки Tygon и регулятор.
Настольная центрифуга

)