Все процедуры, связанные со сбором образцов, были выполнены в соответствии с рекомендациями института IRB.
ВНИМАНИЕ: Работа с образцами человеческой крови и малярийными паразитами требует мер предосторожности. Всегда надевайте лабораторный халат и перчатки и работайте в шкафу биобезопасности уровня 2. В случае случайного чрескожного контакта с малярией человека сообщить в Департамент здравоохранения и безопасности для профилактического лечения. При работе с кровью, инфицированной вирусом иммунодефицита человека, ВИЧ(+) также следует принимать дополнительные меры безопасности. Наденьте лабораторный халат, закрывающий спину. Двойная перчатка (верхняя перчатка должна быть латексной). Выполняйте все операции в шкафу биобезопасности уровня 2. Не используйте стекло или острые предметы. Не используйте аспиратор. Поместите все загрязненные предметы в раствор вирокса или отбеливатель минимум на 1 час перед выбросом. Вымойте все поверхности вироксом и ультрафиолетом (УФ) в течение 1 часа после использования. Обратите внимание, что в каждом учреждении будут свои специфические правила биобезопасности, которые необходимо соблюдать. Сообщайте обо всех случайных контактах с ВИЧ-инфицированной кровью в Health and Safety для оценки и рассмотрения возможных мер постконтактной профилактики.
Примечание: Существуют различные штаммы малярийных паразитов P. falciparum. Для этих экспериментов использовался ITG, но можно использовать и другие штаммы. Отличные инструкции по замораживанию и размораживанию паразитов Plasmodium falciparum доступны на веб-сайте MR4.
1. Создание RPMI-A для культивирования малярийных паразитов
- Приготовьте RPMI-0, смешав 950 мл дважды дистиллированной воды (ddH2O), 1 пакетик порошка Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640, 6 г N-2-гидроксиэтилпиперазина-N-2-этановой сульфоновой кислоты (HEPES), 2 г бикарбоната натрия и 1,35 мг гипоксантина.
- Размораживание инактивированной при нагревании человеческой сыворотки от двух разных доноров. Доноры AB являются лучшими, но любые могут быть использованы, если паразиты выращиваются в эритроцитах (эритроцитах) O-типа. Переверните трубки для перемешивания. Если сыворотка содержит твердые частицы или является густой, отжимайте со скоростью 2000 об/мин, а затем фильтруйте жидкую часть с помощью фильтрующей установки 0,45 мкм.
- С помощью фильтрующей установки 0,2 мкм фильтруют 180 мл RPMI-0, 20 мл сыворотки крови человека (по 10 мл от каждого донора) и 0,5 мл 10 мг/мл гентамицина.
заметка: Человеческая сыворотка может засорить фильтр, поэтому может потребоваться более одной фильтрующей установки.
- На флаконе среднего размера должна быть указана информация RPMI-A, указана дата и источник сыворотки. Охладите до тех пор, пока не потребуется. RPMI-A может мутнеть при хранении в холодильнике. Это нормально, но увеличение облачности является признаком загрязнения.
заметка: Рост паразитов может варьироваться в разных донорских сыворотках. Перед использованием рекомендуется проверять все партии сыворотки крови человека на хороший рост паразитов.
2. Подготовка эритроцитов человека к культивированию паразитов
Примечание: Доноры крови должны быть группы O.
- Соберите 7-10 мл крови в пробирки с цитрат-цитрат-декстрозой (АХД). Напишите на этикетке удостоверение личности донора и дату сбора.
- Храните кровь при температуре 4 °C до тех пор, пока она не понадобится. Используйте кровь для посева паразитов в течение 1 месяца.
- Протрите верхнюю часть тюбика 70% этанолом. Осторожно снимите пробку и выбросьте ее. Перелейте кровь в пробирку объемом 15 мл. Вращайте в течение 3 минут при давлении 1 000 x g. Удалить плазму методом аспирации.
- Суспензируйте эритроциты с равным объемом теплого РПМИ-0. Вращайте в течение 5 минут при давлении 1 000 x g. Снимите охристую шерсть методом аспирации, повторно суспендируйте в 5 мл РПМИ-0, и повторите стирку еще 2 раза.
- Удалите надосадочную жидкость и добавьте достаточное количество RPMI-A, чтобы получить смесь с 50% объемного содержания эритроцитов.
- Хранить при температуре 4 °Cдо тех пор, пока не понадобится.
3. Поддержание паразитарных культур
- Предварительно прогрейте RPMI-A до 37 °C.
- Поместите размороженных паразитов (см. протокол MR4 для процедуры размораживания) в колбу T25 с 5 мл RPMI-A и 75 мкл промытых эритроцитов человека для получения гематокрита ~3%. заметка: Гематокрит измеряет объем эритроцитов по сравнению с общим объемом. Для расчета гематокрита измеряют объем упакованных эритроцитов к общему объему среды плюс эритроциты. Предположим, что размороженные паразиты внесут 75 мкл эритроцитов. При добавлении 150 мкл запаса эритроцитов (что эквивалентно добавлению 75 мкл упакованных эритроцитов) в колбу получается всего 150 мкл эритроцитов на 5 мл среды, что составляет гематокрит 3% (150 мкл/5000 мкл x 100% = 3%).
- Отравите колбу в течение 30 секунд газовой смесью паразитов (1%О2, 3%СО2, остаток N2). Закройте и поместите колбу широкой стороной вниз в инкубатор с температурой 37 °C так, чтобы обеспечить максимальную площадь поверхности для газообмена.
- Чтобы сменить среду и проверить на паразитемию (нужно делать ежедневно), осторожно перемещайте колбу, чтобы не потревожить слой эритроцитов. С помощью стерильной, отключенной от сети пипетки Пастера удалите питательную среду, не нарушая слой крови.
- Чтобы проверить паразитемию, извлеките образец объемом 10 мкл из слоя крови, поместите его на предметное стекло и с помощью второго предметного стекла создайте тонкую кровяную пленку. Дайте предметному стеклу высохнуть.
- Поместите в колбу 4 мл свежего RPMI-A, аккуратно перемешайте, газируйте в течение 30 секунд и поместите в инкубатор при температуре 37 °C.
- Окрасьте предметное стекло с помощью набора для окрашивания Hema3 в соответствии с протоколом производителя.
- Для оптимального окрашивания окуните предметные стекла в фиксирующий раствор на 10 секунд, раствор I на 10 секунд и раствор II на 30 секунд. Промойте в воде и дайте предметным стеклам высохнуть.
- Рассчитайте паразитемию, подсчитав количество эритроцитов Plasmodium falciparum, PfRBC (окрашенных в темно-фиолетовый цвет) в сравнении с общим количеством эритроцитов (окрашенных в розовый цвет). Посчитайте в общей сложности 300 ячеек, чтобы обеспечить точность.
- Когда паразиты достигнут паразитемии 5%, разверните культуру в колбе T75, используя 40 мл RPMI-A и 500 мкл эритроцитов.
4. Синхронизация паразитов
Примечание: За день до эксперимента синхронизируйте культуру паразита, обработав ее аланином. Только кольцевые паразиты и неинфицированные эритроциты выживут после этого лечения. Синхронизация аланина даст вам на следующий день чистую культуру трофозоитов, которую можно использовать в экспериментах по совместному культивированию. Обязательно начните с культуры паразитов, которая содержит большинство паразитов кольцевой стадии.
- Приготовьте раствор аланина, смешав 8,01 г аланина (300 мМ) и 0,365 г триса (10 мМ) с 300 мл ddH2O. Доведите pH до 7,4. Фильтр стерилизуется с помощью фильтрующего блока 0,2 мкм.
- Предварительно подогрейте раствор аланина до 37 оС.
- Уменьшите культуру паразитов (5 мин х 1000 х г) и удалите среду.
- Ресуспендировать пеллеты в 19 объемах раствора аланина (1 мл упакованных эритроцитов на 19 мл раствора аланина). Выдерживать в течение 15 минут при комнатной температуре (RT).
- Отжим 5 мин x 1,000 x g. Надосадочная жидкость аспирата. Постирайте в RPMI-0 один раз. Аспират надосадочная жидкость и ресуспендия в RPMI-A и коррекция гематокрита до ~3%. Газовая колба и возврат до 37 °C. <бр/>
заметка: Для экспериментов по совместному культивированию необходима минимальная паразитемия в 5% трофозоитов, при этом оптимальной считается 10% паразитемии.
5. Подготовка паразитов и эритроцитов к экспериментам по совместному культуре
- Используйте соотношение 3 PfRBC на PBMC в экспериментах с совместным культивированием, чтобы вызвать воспалительную реакцию. Чтобы рассчитать общее количество PfRBC, количественно оцените паразитемию, сделав тонкий мазок крови, как описано в 3.5, и гематокрит, подсчитав количество эритроцитов на мл культуры паразита с помощью гемоцитометра.
Количество PfRBC = % паразитемии x общее количество эритроцитов/мл x мл культуры. Например, 10 мл культуры при 10 х10 6 эритроцитов/мл и 10% паразитемии равны 0,1 х 106/мл х 10 мл = 10 х10 6 ПфРБК.
- Вращайте культуру паразита в течение 5 минут при 1000 x g (RT). Аспирируйте среду и ресуспендируйте в дозе 6 x 106 PfRBC на мл в RPMI-S+ (500 мл RPMI-1640 с добавлением L-глутамина и HEPES, 10% инактивированной тепловой инактивированной фетальной бычьей сыворотки (FBS), 1,5 мл гентамицина, 5 мл 100 мМ пирувата натрия, 5 мл 10 мМ заменимых аминокислот MEM, 5 мл 5 мМ β-меркаптоэтанола).
- Возьмите контрольную кровь (неинфицированные эритроциты от того же донора, который использовался для поддержания культуры паразита), рассчитают гематокрит и ресуспендируют в RPMI-S+ с тем же количеством эритроцитов на мл, что и в культуре паразита.
6. Выделение мононуклеарных клеток периферической крови человека (PBMC)
- Соберите венозную кровь в пробирки с гепарином натрия (зеленый вверху) как у донора с хроническим ВИЧ(+), так и у контрольного донора ВИЧ(-). Не используйте этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТА) в качестве антикоагулянта, так как хелатирующее действие ЭДТА влияет на функцию клеток. В среднем следует ожидать от 5-10 х10 до 6 ПМК на 10 мл крови. Для типичного эксперимента соберите по 30 мл крови от каждого донора. Объем крови необходимо будет скорректировать в соответствии с требованиями эксперимента.
- Как можно быстрее и обязательно в течение часа после сбора крови извлеките кровь из пробирок и поместите ее в пластиковую пробирку объемом 50 мл. Моноциты, в частности, активируются и прилипают к стеклу, поэтому важно, чтобы при использовании стеклянных пробирок для сбора крови клетки удалялись как можно быстрее.
- Вращайте кровь при давлении 1000 x g в течение 15 минут и соберите плазму (при необходимости это можно использовать для других исследований – если нет, этот шаг можно пропустить). Разбавьте кровь в равном объеме холодного фосфатно-солевого буфера Дульбекко (DPBS).
- Поместите 15 мл RT Ficoll в пробирку объемом 50 мл. Медленно, используя стерильную пластиковую пипетку, нанесите слой раствора крови/DPBS на Ficoll без какого-либо перемешивания. Максимум 25 мл раствора крови/DPBS можно нанести на каждые 15 мл Ficoll.
- Вращайте градиенты в течение 30 минут при RT при 600 x g. Убедитесь, что включена настройка «без тормоза».
- После того, как ячейки закрутились, ищите границу между двумя фазами. Вот где находятся PBMC. С помощью стерильной пластиковой трансферной пипетки соберите ПБМК с интерфейса (см. рисунок 1). Сведите к минимуму загрязнение эритроцитами.
- Поместите собранные клетки в пробирки по 50 мл, не более 20 мл на пробирку. Верхний туба объемом до 50 мл со стерильным холодным DPBS.
- Вращайте ячейки в течение 10 минут при 4 °C при 300 x g.
- Выбросьте надосадочную жидкость, повторно суспендируйте гранулу в 5 мл стерильного холодного DPBS и объедините все клетки от одного донора в одну пробирку. Долейте до 50 мл стерильным DPBS, и повторите действия промывания еще 2 раза.
- Ресуспендируйте клетки в среде RPMI-S+ объемом 10 мл.
- Удалите 20 мкл аликвоты и смешайте с 20 мкл трипанового синего. Пипеткой нанесите 10 мкл в гемоцитометр и подсчитайте живые клетки (клетки, которые не впитали синий краситель – все синие клетки мертвы). С помощью гемоцитометра вычислите количество клеток в растворе следующим образом.
заметка: Гемоцитометр имеет сетку заданных размеров, чтобы была известна площадь, охватываемая линиями.
- Убедитесь, что гемоцитометр чистый. Положите покровную крышку на область подсчета. Загрузите 10 μл раствора ячейки, поместив наконечник пипетки в одну из V-образных лунок. Область под покровным стеклом будет заполнена капиллярным действием.
- Поместите загруженный гемоцитометр под микроскоп. Полная сетка гемоцитометра содержит 9 квадратов по 1 мм2 каждая. Посчитайте все ячейки в каждом большом квадрате. Если клеток слишком много, разведите раствор дальше и пересчитайте.
- Рассчитайте концентрацию клеток следующим образом: Общее количество клеток/мл = (общее количество клеток/# квадратов) x фактор разведения x 10 000 клеток/мл, например, (500 клеток/5 квадратов) x коэффициент разбавления 20 x 10 000 клеток/мл = 20 x 106 клеток.
- Отрегулируйте среду до конечной концентрации 10 x 106 на мл (среда RPMI-S+).
7. Культура коинфекции малярии/ВИЧ
- Планшет 100 мкл выделенных PBMC и 400 μл RPMI-S+ среднего до 24-луночного планшета (1 x 106 PBMC на лунку). Убедитесь, что лунки расположены в трех экземплярах: 3 лунки для неинфицированных эритроцитов, 3 лунки с PfRBC, 3 лунки со средой и 3 лунки с PMA/иономицином. Это относится как к образцам HIV(+), так и к HIV(-).
- Для лунок PfRBC поместите 3 x 106 PfRBC в каждую из лунок (500 мкл культуры паразитов, приготовленной в 5,2).
- Для неинфицированных эритроцитных лунок поместите 500 мкл неинфицированной культуры эритроцитов, приготовленной в 5,3, в каждую из лунок.
- Для средних лунок поместите по 500 μл среды RPMI-S+ в каждую из лунок.
- Для лунок с ПМА/иономицином готовят раствор ПМА/иономицина (2,5 пг/мл, 250 пг/мл соответственно). Поместите по 500 μл этого раствора в каждую лунку.
заметка: В качестве мощных стимуляторов секреции цитокинов Т-клетками, PMA и иономицин используются в качестве положительного контроля для обеспечения функциональности клеток.
- Поместите планшет при температуре 37 °C в инкубатор с 5%CO2.
- Дополнительно: использовать избыточные клетки для фенотипического анализа с помощью проточной цитометрии или хранить их в растворе для стабилизации РНК для будущего анализа экспрессии мРНК.
8. Обнаружение иммунных реакций малярии
Примечание: Проводите эксперименты по совместной культуре в течение 4 дней. В течение этого времени смена носителя не требуется. Оптимальный временной момент будет зависеть от типа интересующей клетки и заданного вопроса. Инкубация в течение 12-48 часов является оптимальной для моноцитарных ответов на PfRBCs, в то время как ответы лимфоцитов лучше всего наблюдались через 72-96 часов. Временные точки необходимо будет оптимизировать на основе экспериментального вопроса. Более короткие периоды (2-4 часа) могут быть использованы, если представляет интерес взаимодействие между интактным PfRBC и PBMC.
- Вращайте пластину при 300 x g в течение 3 минут в ячейки для гранул. Соберите по 700 мкл надосадочной жидкости из каждой лунки.
- Отжимайте надосадочную жидкость при 1 000 x g в течение 5 минут, чтобы очистить от мусора.
- При необходимости очистите надосадочную жидкость от аликвоты, пометьте и заморозьте при температуре ниже -20 °C до тех пор, пока не будет проведен анализ секретируемых факторов.
