Методическая статья

Индукция реакции «трансплантат против хозяина» у мышей с помощью аллогенной трансплантации костного мозга и селезеночных клеток

8 июля 2025 г.

В этой статье

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Источник: Buchele, V., et al. Индукция кишечного трансплантата против хозяина и его мини-эндоскопическая оценка у живых мышей. J. Vis. Exp. (2019).

Это видео демонстрирует индукцию кишечного трансплантата против хозяина, РТПХ, у летально облученной мыши-реципиента с использованием аллогенных гемопоэтических стволовых клеток и аллореактивных Т-лимфоцитов селезенки, индуцирующих РТПХ. Этот протокол помогает создать модель тяжелой острой кишечной РТПХ, чтобы понять механизм заболевания и разработать инновационные терапевтические варианты.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.

1. Индукция GvHD

  1. День 0: Тотальное облучение тела мышей-реципиентов
    1. В качестве реципиентов используйте самок мышей CD45.2+ H2kd+ BALB/c, возраст которых составляет не менее 10 недель.
    2. Взвесьте и запишите вес мышей-реципиентов до индукции РТПХ.
      заметка: Убедитесь, что минимальная масса тела реципиента составляет 20 г. Начальная масса тела будет служить эталонной величиной для расчета потери веса отдельной мыши в процессе индукции и прогрессирования GvHD.
    3. Поместите до пяти мышей в контейнер рентгеновского облучателя.
    4. Облучите мышей путем полного облучения тела однократной дозой рентгеновского излучения 8 Гр. Используйте Cs137 в качестве источника излучения.
  2. День 1: Восстановление облученных мышей с истощенным Т-клетками костным мозгом
    заметка: Трансплантация аллогенных клеток костного мозга, как описано и подробно описано в разделе 1.2, должна быть проведена в течение 24 часов после облучения. Выполняйте описанные ниже процедуры в стерильном капюшоне для культуры тканей и используйте отфильтрованные реактивы. Используйте аллогенный CD45.1/Ly5.1 B6. Мыши SJL-Ptprca Pepcb/BoyCrl в качестве доноров костного мозга с истощением Т-клеток.
    1. Усыпить CD45.1/Ly5.1 B6. Мыши SJL, которые будут донорами аллогенных клеток костного мозга в соответствии с институциональными рекомендациями, через 12-24 ч после облучения мышей-реципиентов BALB/c. Для этого сделайте анестезию CD45.1/Ly5.1 B6. SJL мышам путем ингаляции 5% изофлурана. Продолжайте воздействие изофлурана в течение 1 минуты после остановки дыхания и подтвердите эвтаназию путем вывиха шейки матки.
    2. Тщательно продезинфицируйте шерсть и кожу мыши 70% этанолом.
    3. Поместите мышь на чистую рабочую оболочку так, чтобы мышь находилась в положении лежа, а задние конечности были обращены к экспериментатору. Приподнимите мех у ахиллесовой пяты с помощью кончика щипцов Семкена длиной 13 см и зубчатыми изогнутыми кончиками. Надрежьте кожу между щипцами и пяткой закаленными тонкими ножницами толщиной 8,5 см с прямыми кончиками.
    4. Удлиняют разрез краниально (т. е. от пятки через голень и бедро к области бедра). Удалите кожу и шерсть с задней конечности с помощью щипцов.
    5. Проделайте ту же процедуру на другой задней конечности.
    6. Удалите задние конечности, разрезав соседние тазобедренные суставы.
    7. Отрежьте задние лапы. Разрежьте коленный сустав. Храните бедро и голяшку каждой задней конечности вместе в чашке Петри диаметром 92 мм, заполненной фосфатно-солевым буферным раствором (PBS) на льду.
    8. Тщательно очистите бедренную и большеберцовую кости, удалив как можно больше мышечной ткани с каждого бедра и голени. Перенесите бедренную и большеберцовую кости в трубку объемом 50 мл, заполненную стерильной средой RPMI 1640, и поместите ее на влажный лед до тех пор, пока все большеберцовые и бедренные кости, собранные на шаге 1.2.7, не будут очищены от мышечной ткани.
    9. Чтобы изолировать костный мозг, необходимо перенести по одной бедренной или большеберцовой кости за раз (которая была очищена, как описано в шаге 1.2.8) из пробирки объемом 50 мл в чашку Петри (диаметром 92 мм), заполненную средой RPMI 1640. Отрежьте концы бедренной или большеберцовой кости скальпелем, чтобы получить доступ к полости кости, содержащей костный мозг.
    10. Приготовьте пробирку для сбора объемом 50 мл с 5 мл среды RPMI 1640. Введите иглу 26 G, прикрепленную к шприцу объемом 1 мл, наполненному 1 мл среды RPMI 1640, в костную полость и промойте костный мозг из полости в пробирку для сбора, нажав на поршень.
    11. Повторяйте шаг 1.2.10 до тех пор, пока кость не станет светлой и блестящей (т.е. костная полость не будет заметно лишена красноватого костного мозга). Выбросьте пустую кость.
    12. Повторите шаги 1.2.9 - 1.2.11, используя все бедренные и большеберцовые кости из шага 1.2.8, и соберите все восстановленные кусочки костного мозга в ту же пробирку для сбора объемом 50 мл из шага 1.2.10. Держите пробирку для сбора на влажном льду до тех пор, пока все кости из шага 1.2.8 не будут обработаны соответствующим образом.
    13. Создайте одноклеточную суспензию, мягко пипетируя промытые, рассыпчатые кусочки костного мозга вверх и вниз. Отфильтруйте одноклеточную суспензию костного мозга через сетчатое ситечко, помещенное в новую пробирку для сбора 50 мл.
    14. Центрифугируйте пробирку для сбора объемом 50 мл, содержащую суспензию одиночных клеток костного мозга, при концентрации 450 x g в течение 5 мин при 4 °C. Выбросьте надосадочную жидкость.
    15. Ресуспендируйте гранулу в 5 мл лизирующего буфера ACK (1 мМ Na2EDTA; 10 мМ KHCO3; 144 мМ NH4Cl; pH 7,2) для лизиса эритроцитов. Инкубировать клеточную суспензию в течение 3 мин при комнатной температуре. После этого немедленно добавьте 10 мл раствора PBS в клеточную суспензию.
    16. Центрифугируйте суспензию при 450 х г в течение 5 мин при 4 °С. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клетки в 2 мл раствора PBS.
    17. Подсчитайте клетки костного мозга, используя гемоцитометр. Сохраняйте аликвоту 6 x 106 клеток для анализа проточной цитометрии, чтобы проверить чистоту клеток после очистки клеток (см. шаг 1.2.20).
    18. Для истощения Т-клеток из суспензии одиночных клеток костного мозга используйте коммерчески доступный набор для очистки клеток. Магнитное истощение CD90.2+ клеток (т.е. лимфоцитов) из всех клеток костного мозга в соответствии с протоколом производителя.
    19. Подсчитайте истощенные Т-клетками клетки костного мозга, которые были выделены, как описано в шаге 1.2.18, с помощью гемоцитометра. Сохраните аликвоту 1 x 106 клеток для последующего анализа проточной цитометрии, как описано в шаге 1.2.20.
      заметка: Средний выход клеток, полученный от одной донорской мыши, обычно составляет от 2 x 107 до 3,4 x 107 клеток костного мозга, истощенных Т-клетками.
    20. Подтвердите успешное истощение Т-клеток с помощью проточной цитометрии. Окрашивание 1 x 106 клеток, сохраненных с этапов 1.2.17 (клетки костного мозга до магнитного разделения клеток) и 1.2.19 (клетки костного мозга, истощенные Т-клетками после магнитного разделения клеток), следующими антителами: α-CD45.1 (A20), α-CD3 (17A2), α-CD4 (GK1.5) и α-CD8α (53-6.7). Используйте оставшиеся клетки из шага 1.2.17 в качестве неокрашенного контроля и для контроля одиночного окрашивания для настройки проточного цитометра.
      1. Перенесите 1 x 106 клеток из каждого образца в лунку 96-луночного планшета с V-образным дном для выполнения процедуры проточного цитометрического окрашивания.
      2. Раскрутите клетки в 96-луночном планшете (шаг 1.2.20.1) при 450 x g в течение 5 мин при 4 °C. Удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клетки в 100 мкл буфера FACS (PBS с добавлением 3% фильтрованной бычьей сыворотки).
      3. Центрифугируйте клетки в 96-луночном планшете при 450 x g в течение 5 мин при 4 °C. Выбросьте надосадочную жидкость.
      4. Добавьте соответствующее количество выбранного антитела (сравните с шагом 1.2.20) к образцам для однократного окрашивания в 100 мкл буфера FACS.
      5. Готовят смесь всех антител (мастер-смесь), содержащую соответствующие количества, достаточные для раздельного окрашивания аликвот клеток костного мозга, сохранившихся от до (см. шаг 1.2.17) и после (см. шаг 1.2.19) магнитного истощения Т-клеток. Добавьте 100 μL мастер-смеси к обеим аликвотам.
      6. Добавьте в неокрашенный образец всего 100 мкл буфера FACS.
      7. Инкубируйте клетки в 96-луночном планшете в течение 20 минут при 4 °C в темноте.
      8. Добавьте 100 мкл буфера FACS и центрифугируйте клетки в 96-луночном планшете при 450 x g в течение 5 мин при 4 °C. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клетки в 100 мкл буфера FACS.
      9. Центрифугируйте клетки при 450 x g в течение 5 мин при 4 °C. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клетки в 250 мкл буфера FACS.
      10. Перенесите образцы в полистирольную пробирку с круглым дном объемом 5 мл и проанализируйте их с помощью проточного цитометра, способного обнаруживать флуоресцентные молекулы, которые использовались для мечения антител, используемых для определения характеристик образцов клеток (см. шаг 1.2.20).
      11. Сравните состав ячеек до и после разделения магнитных ячеек.
        заметка: Обычно достигается чистота примерно 95% CD45.1+CD3- (т.е. истощенных Т-клетками костного мозга) клеток в пределах живых ворот.
    21. Суспензию клеток костного мозга, обедненных Т-клетками, 2 раза промывают раствором PBS (450 x g в течение 5 мин при 4 °C) и, наконец, ресуспендируют клетки в растворе PBS, регулируя концентрацию клеток до 5 x 107 клеток/мл. Держите клетки на влажном льду до момента инъекции.
    22. Вводите истощенные Т-клетками клетки костного мозга мышам-реципиентам, которые были облучены накануне (см. раздел «Побочные эффекты»).
      1. Поместите экспериментальную мышь в герметичную камеру и введите анестезию путем ингаляции до 4% изофлурана до тех пор, пока мышь не потеряет сознание. Подтвердите анальгезию и потерю сознания путем тестирования на потерю рефлекса выпрямления и последующую потерю рефлекса отвода педали.
      2. Введите 5 x 106 Т-истощенных клеток костного мозга (т.е. 100 мкл 5x107 клеток/мл), содержащих раствор PBS, с помощью шприца объемом 1 мл, оснащенного иглой 30 G, внутривенно в ретробульбарное пространство, содержащее венозный синус.
  3. День 2: Перенос Т-клеток
    заметка: Описанные ниже процедуры выполняют в стерильном культуральном шкафу для тканей и используют отфильтрованные реактивы. Используйте CD45.2 C57Bl/6 (дикого типа; WT) в качестве доноров аллореактивных Т-клеток. Использование конгенных маркерных систем позволяет различить типы гемопоэтических клеток реципиента (CD45.2+ H2kd+ Balb/c) и донора (клетки костного мозга: CD45.1+ H2kb+ B6). мыши SJL; аллогенные Т-клетки: мыши CD45.2+ H2kb+ C57/Bl6).
    1. Усыпляйте мышей C57Bl/6 в соответствии с действующими институциональными рекомендациями и органами. Поэтому обезболивайте мышей ингаляцией с концентрацией 5% изофлурана. Продолжайте воздействие изофлурана до 1 минуты после остановки дыхания и подтвердите эвтаназию путем вывиха шейки матки. Тщательно продезинфицируйте шерсть и кожу мыши 70% этанолом.
    2. Поместите ситечко с сетчатым экраном 40 μм на пробирку для сбора объемом 50 мл. Удалите селезенку и положите ее на ситечко.
    3. С помощью поршня шприца измельчите селезенку в ситечко. Промойте ситечко и поршень шприца PBS, чтобы собрать все спленоциты.
    4. Центрифугируйте клетки в пробирке для сбора объемом 50 мл при давлении 450 x g в течение 5 мин при 4 °C. Выбросьте надосадочную жидкость.
    5. Ресуспендируйте спленоциты в 3 мл лизирующего буфера ACK для лизирования эритроцитов. Инкубировать клеточную суспензию в течение 3 мин. После этого добавьте 10 мл PBS и центрифугируйте клетки при 450 x g в течение 5 минут при 4 °C. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте спленоциты в PBS.
    6. Подсчитайте клетки селезенки, используя гемоцитометр. Отвлеките аликвоту из 6 x 106 клеток для анализа проточной цитометрии, чтобы оценить величину очистки на шаге 1.3.9.
    7. Для полного выделения CD3+ Т-клеток из общего количества спленоцитов используйте коммерчески доступный набор для очистки клеток. Выделите Т-клетки селезенки, следуя протоколу производителя.
    8. Подсчитайте выделенные CD3+ Т-клетки селезенки, как описано в шаге 1.3.7, с помощью гемоцитометра. Сохраните аликвоту из 1 x 106 Т-клеток для анализа проточной цитометрии.
      заметка: Средний выход Т-клеток селезенки на одну донорскую мышь, выделенную магнитным разделением клеток, колеблется от 1,3 x 107 до 2 x 107 клеток.
    9. Подтвердите успешность выделения Т-клеток с помощью проточной цитометрии. Для получения подробного описания протокола окрашивания обратитесь к шагам 1.2.20.1 - 1.2.20.10 и выполните следующие действия.
      1. Окрашивают 1 x 106 спленоцитов этапов 1.3.6 (до магнитного разделения клеток) и 1.3.8 (после магнитного разделения клеток) следующими антителами: α-CD45.2 (104), α-CD3 (17A2), α-CD4 (GK1.5) и α-CD8α (53-6.7).
      2. Используйте оставшиеся клетки, показанные на шаге 1.3.6, в качестве неокрашенного контроля и для однократного окрашивания соответствующими антителами для настройки проточного цитометра.
      3. Сравните состав клеток до и после разделения магнитных элементов.
        заметка: Должна быть достигнута чистота ≥95% CD45,2+CD3+ Т-клеток в живых воротах лимфоцитов.
    10. Промойте Т-клетки 2 раза PBS (450 x g в течение 5 минут при 4 °C) и, наконец, повторно суспендируйте клетки в растворе PBS, регулируя концентрацию клеток до 7 x 106 клеток/мл. Держите клетки на льду до момента инъекции.
    11. Введите аллореактивные Т-клетки селезенки (см. шаг 1.3.10) облученным мышам BALB/c, которые ранее получали CD45.1+ Т-клетки костного мозга с истощением CD45.1 (см. шаг 1.2.22).
      1. Индуцируйте анестезию, поместив экспериментальную мышь в герметичную камеру, в которой она подвергается воздействию до 4% изофлурана до тех пор, пока она не потеряет сознание. Подтвердите анальгезию и потерю сознания путем тестирования на потерю рефлекса выпрямления и последующую потерю рефлекса отвода педали.
      2. Введите 0,7 x 106 аллореактивных CD3+ Т-клеток с помощью шприца объемом 1 мл, оснащенного иглой 30 G (т.е. 100 мкл 7 x 106 клеток/мл), содержащей раствор PBS (см. шаг 1.3.10), внутривенно в ретробульбарное пространство мышей, чтобы индуцировать РТПХ. Определите этих мышей в качестве экспериментальной группы.
      3. Введите другой группе мышей 100 мкл PBS внутривенно в ретробульбарное пространство и определите эту группу как контрольную группу, впоследствии названную «мышами, не трансплантированными Т-клетками (noT)».

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Конфликт интересов не декларируется.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Гамма-облучатель BIOBEAM 2000Гамма-Сервис Мейкал ГмбХ
Фосфатно-солевой буфер (PBS)ООО «Сигма-Олдрич Ко.».D8662-6x500ML
Щипцы Semken (длина: 13 см; зубчатые, изогнутые кончики)Инструменты для точной науки11009-13
Закаленные тонкие ножницы (длина: 8,5 см; прямые кончики; режущая кромка: 24 мм)Инструменты для точной науки14090-09
RPMI-1640 СреднийООО «Сигма-Олдрич Ко.».Р8758-500МЛ
Игла для подкожных инъекций (26G)Б. Браун Мельзунген АГ4657683
1 мл шприцаБ. Браун Мельзунген АГ9166017В
Тюбик 50 млSarstedt Ag & Co.KG6,25,47,254
Сетчатый фильтр с сетчатым экраном 40 μмBD Falcon352340 (Английский
Инсулиновый шприц со стерильной внутренней частью (30Г)БД324826
Набор для изоляции Т-клеток Pan T Cell Isolation Kit II, мышьМилтеньи Биотек ГмбХТел.: 130-095-130разделение магнитных клеток для выделения Т-клеток селезенки
CD90.2 Микрогранулы, мышьМилтеньи Биотек ГмбХТел.: 130-049-101отделение магнитных клеток для выделения Т-клеток истощенных клетками костного мозга
Щипцы для биопсииKARL STORZ SE &d KG61071 ЗЖЧасть экспериментальной установки для колоноскопии
Этилендиаминтетрауксусная кислота дигидрат динатриевой соли (Na2EDTA)Carl Roth GmbH & Co.KG8043.2ингредиент лизирующего буфера ACK
Alexa Fluor 700 антитело к мышиному CD45.2 (клон: 104; лот: B252126; RRID: AB_493731)Биолегенда109822
PE/Cy7 антитело к мышиному CD45.1 (клон: A20; партия: B217246; RRID: AB_1134168)Биолегенда110730 Номер 110730
Антитело к мышиному CD8a APC/Cy7 (клон: 53-6.7, партия: B247008; RRID: AB_312753)Биолегенда100714
Форан / ИзофлуранAbbVie Inc.В506
Фильтрованная бычья сывороткаПан БиотекП40-47500ингредиент буфера FACS
)

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи