1. Экстракорпоральная очистка спорозоитов от ооцист C. parvum in vitro
- Очистите спорозоиты от ооцист C. parvum после отбеливания и вымывания отбеливателя, как описано выше.
- Перенесите ооцисты в трубку объемом 15 мл. Ресуспендируйте ооцисты в среду для эксцизма при комнатной температуре (0,75% по сравнению с таурохолатом натрия в DMEM) с получением 1 x 107 ооцист/мл. Добавление таурохолата улучшает скорость эксцесации ооцист, улучшая выход спорозоита.
- Инкубировать суспензию ооцисты при 37 °С в течение 1–1,5 ч.
- Проверьте образец под микроскопом на степень эксцизма; 60–80% эксцистации является приемлемым для хорошего извлечения спорозоитов. Если уровень эксцитации низкий, инкубируйте дольше (еще от 30 мин до 1 ч).
- Определите процент эксцессионности относительно количества стартовых ооцист. Excystation рассчитывается как:
% эксцесс = [1 – (количество интактных ооцист/количество ооцист в начале)] x 100
- Промойте клетки для удаления эксистатирующих реагентов путем добавления 14 мл PBS или среды, смешивая и восстанавливая клетки (интактные ооцисты, оболочки ооцисты и спорозоиты) центрифугированием при 3400 x g в течение 20 минут для восстановления спорозоитов. Тщательно отсаживайте, чтобы избежать потери клеток.
- Ресуспендируйте гранулу спорозоита в 1–2 мл DMEM с получением 3 x 107 ооцист/мл (в зависимости от количества исходных ооцист).
- Чтобы удалить оставшиеся ооцисты и оболочки, отфильтруйте суспензию через фильтр 3 мкм (рис. 1В). Используйте фильтродержатель диаметром 47 мм, оснащенный поликарбонатным фильтром (размер пор 3 мкм), прикрепленный к цилиндру шприца объемом 10 мл. Поместите фильтродержатель на пробирку объемом 15 мл. Поместите сборку в ведро со льдом или в холодное помещение.
- Добавьте 7,5 мл спорозоитной суспензии в фильтрующий узел и дайте ему профильтроваться под действием силы тяжести. Промойте еще 7,5 мл DMEM.
заметка: Для обеспечения успеха в выделении спорозоитов решающее значение имеют свежие ооцисты и хорошая эксцессия. Если неэксцистированных ооцист слишком много, суспензия не будет протекать под действием силы тяжести. Давление на шприц может протолкнуть неэксцистированную ооцисту. Микроинъекция спорозоитов является более сложной задачей, чем микроинъекция ооцист, поскольку спорозоиты могут слипаться и блокировать капилляры. Чтобы этого избежать, мы рекомендуем делать более широкий капиллярный наконечник при введении органоидов со спорозоитами. Для достижения достаточного уровня инфекции в каждый органоид необходимо ввести в 2–4 раза больше спорозоитов по сравнению с органоидами, инфицированными ооцистами.
- Центрифугируйте отфильтрованную суспензию спорозоитов при давлении 3 400 x g с помощью качающегося ротора ковша в течение 20 мин для гранулирования спорозоитов.
- Ресуспендируйте в 50–100 мкл органоидной питательной среды OME или OMD (см. Таблицу материалов) с добавлением 0,05% (w/v) красителя Fast Green и L-глутатиона, бетаина, L-цистеина, линолевой кислоты и тауриносодержащего восстановительного буфера (см. Таблицу материалов).
заметка: Слишком длительная инкубация ооцист может привести к лизису спорозоитов и плохому восстановлению, поэтому ее следует избегать.
2. Культура in vitro кишечника человека для микроинъекций
- Культивирование кишечных органоидов в условиях среды расширения и дифференцировки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Подробности кишечного размножения ранее были описаны в других статьях (см. Таблицу материалов для рецептов сред). Здесь мы кратко опишем метод культивирования органоидов с конкретной ссылкой на оптимизацию для инъекции и роста криптоспоридий. Мы обнаружили, что для визуализации паразитов в органоидах органоиды, выращенные в расширяющей среде, предпочтительнее органоидов, выращенных в дифференцировочной среде, поскольку в них происходит меньшее накопление мусора, чем в органоидах, выращенных в дифференцировочной среде. Однако, если цель состоит в том, чтобы изолировать ооцисты, органоиды, выращенные в дифференцировочных средах, производят гораздо большее количество ооцист.
- Поддерживайте органоиды в 3D-культурах во внеклеточном матриксе (см. Таблицу материалов) при температуре 37 °C. Добавьте сверху OME (среду для расширения органоидов) и обновляйте каждый день.
- Чтобы разделить и наплавить органоиды для микроинъекции, удалите среду из 6-луночного планшета, содержащего человеческие органоиды, добавьте в лунку F12+++ (см. таблицу материалов) и разбейте матрицу путем пипетирования наконечником пипетки объемом 1 мл несколько раз. Соберите клетки в пробирку объемом 15 мл (для дальнейших процедур достаточно 2 мл F12+++ на пробирку).
- Добавьте 10–12 мл F12+++ в другую пробирку объемом 15 мл и поместите в среду стеклянную пипетку, отполированную огнем, пипетку вверх и вниз 3 раза, чтобы разрушить органоиды кишечника человека.
заметка: Используйте длинную стеклянную трубку (20–30 см) и коротко отполируйте ее огнем. Не делайте отверстие (диаметр 1 мм) очень маленьким, так как органоиды могут быть повреждены. Сделайте кончик пипетки гладким, кратковременно отполировав его огнем. Разбейте органоиды на более мелкие кусочки размером ~50 мкм.
- Добавьте F12+++ до 5–7 мл и центрифугируйте при 350 x g в течение 5 мин.<бр/>
заметка: Скорость центрифугирования на этом этапе выше обычной, чтобы получить хорошую клеточную гранулу, которая хорошо отделена от внеклеточного матрикса (см. Таблицу материалов). Мы заметили, что по сравнению с органоидами тонкой кишки мышей, органоиды тонкой кишки человека труднее разрушаются.
- Удалите как можно больше среды, не нарушая клетки, затем повторно суспендируйте гранулу с матрицей, поддерживаемой при 4 °C; требуется 200–300 мкл матрицы на лунку шестилуночного планшета. Органоиды должны быть разделены один на три для поддержания достаточно высокой плотности клеток.
- Поместите органоиды в матричные капли объемом около 5–10 мкл каждая в лунку шестилуночного планшета. Инкубируйте в течение 20–30 минут при температуре 37 °C, а затем добавьте сверху расширяющую среду (OME).
- Меняйте носитель каждые 2–3 дня.
заметка: Примерно через 5–7 дней растущие в ЭМ органоиды достигают размера 100–200 мкм и готовы к введению.
- Чтобы дифференцировать органоиды, после 5–6 дней в МЭ измените среду на условия дифференцировочной среды (СД) и выдержите ее еще 5–6 дней перед введением паразитов.
заметка: Для расширения органоидов рекомендуется плотно накладывать органоиды на пластины. Для микроинъекции рекомендуется использовать шестилуночный планшет с органоидами, покрытыми меньшей плотностью. Например, пластинчатые органоиды из трех лунок шестилуночной пластины в полную шестилуночную пластину для микроинъекций. Матрица должна выдерживаться при температуре -20 °C для длительного хранения и размораживать при 4 °C или на льду перед использованием.
3. Микроинъекция ооцист/спорозоитов в просвет органоида
- Микроинъекция паразитов в апикальную сторону 3D-органоида (рис. 2).
- Подготовьте стеклянные капилляры диаметром 1 мм с помощью съемника микропипетки.
заметка: Настройки, используемые на съемнике микропипеток (см. Таблицу материалов): Нагрев = 663, Вытягивание = 100, Скорость = 200, Время = 40 мс. Настройки необходимо будет отрегулировать в соответствии с инструкциями пользователя для конкретной машины.
- Разрежьте кончик капилляра щипцами. Размер/диаметр капиллярного конца составляет около 9–12 мкм; Это обеспечивает легкий отток ооцист (размером 4–5 мкм).
- Заполните капилляры суспензией ооцисты или спорозоита с помощью наконечников микрозагрузчика.
- Загрузите заполненный ооцистой капилляр в микроинъектор.
- Микроинжектируйте 100–200 нл суспензии в каждый органоид под инвертированным микроскопом при 5-кратном увеличении, поддерживая постоянное давление. После микроинъекции ежедневно обновляйте среду с помощью OME или OMD (среда для дифференцировки органоидов) и поддерживайте температуру в планшете на уровне 37 °C.
заметка: Мы не используем микроманипулятор для микроинъекций. Использование одного и того же капилляра рекомендуется на протяжении всего эксперимента, чтобы обеспечить равномерное введение в каждый образец.
