Создание мышиной модели экспериментальной церебральной малярии с использованием спорозоитов, полученных от комаров-хозяев

Аннотация

Источник: Hoffmann, A. et al., Отслеживание развития отека и микрососудистой патологии in vivo в модели экспериментальной церебральной малярии с использованием магнитно-резонансной томографии.J. Vis. Exp.(2017)

Это видео демонстрирует создание экспериментальной мышиной модели мозговой малярии. Спорозоиты, выделенные из самок комаров, инфицированных Plasmodium berghei, вводятся в хвостовые вены мыши, что приводит к нарушению гематоэнцефалического барьера и воспалению мозга, вызывая церебральную малярию. Эта модель инфицированной мыши представляет собой ценный инструмент для изучения in vivo микрососудистой патологии, связанной с церебральной малярией.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.

1. Заражение

1. Заразите комаров Anopheles stephensi Plasmodium berghei ANKA, кормя их в течение 15 минут гаметоцитемической мышью. Держите инфицированных комаров при влажности 80% и температуре 21 °C.
2. Соберите самок комаров из клетки через 17–22 дня после приема пищи с кровью. Положите их на лед, чтобы обезболить.
3. С помощью щипцов поместите три-четыре комара на предметное стекло, покрытое каплей холодной среды RPMI. Поместите предметное стекло под микроскоп.
4. С помощью щипцов аккуратно растяните комара между головой и телом. Изолируйте слюнную железу с помощью шприца и иглы. Повторите эту процедуру с оставшимися комарами.
5. Соберите слюнные железы со предметного стекла, всасыв их стеклянной пипеткой и собрав в центрифужную пробирку объемом 1,5 мл><. заметка: В зависимости от уровня инфицирования, обычно на одну слюнную железу может быть получено от 8 000 до 15 000 инфекционных спорозоитов.
6. В течение примерно 3 минут разбивайте изолированные слюнные железы в центрифужной пробирке небольшой пластиковой палочкой, чтобы изолировать спорозоиты от ткани слюнных желез.
7. Центрифугируйте в течение 3 минут при 1000 x g и 4 °C для очистки спорозоитов от оставшейся ткани.
8. Пипетируйте надосадочную жидкость, содержащую спорозоиты (СПЗ), в новую центрифужную пробирку и подсчитайте очищенные спорозоиты в гемоцитометре Нейбауэра.
9. Отрегулируйте концентрацию очищенных спорозоитов до 10 000/мл, добавив фосфатно-солевой буфер.
10. Введите в общей сложности 1000 спорозоитов (0,1 мл) в хвостовые вены инбредных мышей C57BL/6, чтобы инициировать инфекцию. Чтобы облегчить инъекции, поместите мышей C57BL/6 в ограничитель и опустите хвосты в теплую (примерно 37 °C) воду, чтобы помочь с визуализацией ><хвостовых вен. заметка: Сама инъекция представляет собой короткую процедуру, которая может быть выполнена в течение нескольких секунд.
11. Один раз в день проверяйте паразитемию крови на мазках крови с 3-го дня после заражения СЗЗ.
12. Оценивайте мышей один раз в день по шкале быстрой мышиной комы и поведения (RMCBS), начиная с 5-го дня после инъекции спорозоита.
13. Оцените мышей с помощью магнитно-резонансной томографии (МРТ) в соответствии с шкалой быстрой мышиной комы и поведения (RMCBS) и исследовательским вопросом, на который необходимо ответить.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Изофлуран	Бакстер	1001747	для анестезии
Дотарем	Гебер	1086923	Gd-DTPA контрастное вещество; 0,5 ммоль/мл
Amira (программа обработки изображений)	Группа FEI		Версия Amira 5.3.2
МАТЛАБ	Компания MathWorks, Inc.,		Релиз 2012b
Набор инструментов FDT	Библиотека программного обеспечения FMRIB