Визуализация внеклеточных ловушек в макрофагах из бронхоальвеолярных лаважных жидкостей человека

Аннотация

Источник: Sharma, R. et al., Визуализация внеклеточных ловушек макрофагов с помощью конфокальной микроскопии. J. vis. Exp. (2017)

Это видео демонстрирует иммуномаркировку внеклеточных ловушек макрофагов (MET) в бронхоальвеолярных макрофагах из жидкости бронхоальвеолярного лаважа и их визуализацию с помощью конфокального микроскопа.

Протокол

Все процедуры, связанные со сбором образцов, были выполнены в соответствии с рекомендациями института IRB.

1. Макрофаги бронхоальвеолярного лаважа (БАЛ)

1. Используйте BAL для получения макрофагов легких у (1) людей с помощью бронхоскопии и (2) у мышей с помощью внутритрахеальной аспирации.
   заметка: Приобретение макрофагов обычно вызывает некоторую активацию этих клеток. Макрофаги получают от пациентов, которым требуется бронхоскопия для исследования потенциальной медицинской проблемы, и не все субъекты могут быть пригодны для анализа макрофагальных внеклеточных ловушек или МЕТ (это необходимо будет определить для каждого отдельного проекта).
   1. Возьмите раствор BAL и уменьшите его (500 x g в течение 10 минут) до образования гранулы, дважды промойте питательной средой (Roswell Park Memorial Institute Medium (RPMI) с 5% сывороткой эмбриона телят и 1% L-глутамином) при комнатной температуре, а затем разведите клетки в 4 мл питательной среды.
   2. При необходимости запросите формальный дифференциальный подсчет; большинство клеток (обычно >80%) будут макрофагами.
      заметка: Как правило, это выполняется службой клинической гистологии с использованием морфологического вида различных типов клеток.
   3. Проведите подсчет жизнеспособных макрофагальных клеток на растворе BAL с использованием исключения трипанового синего и гемоцитометра.
      заметка: Раствор BAL получают от людей и мышей, как указано в шаге 1.1.
   4. Добавьте 1 - 4 x 10⁵ макрофагов в 24-луночные планшеты на покровных стеклах в 500 мл питательной среды на лунку и оставьте на ночь при температуре 37°C; клетки прилипнут к покровным стеклам. Для образцов человека добавьте антибиотики (например, пенициллин и стрептомицин, 10⁴ Ед/мл) для предотвращения бактериального загрязнения.

2. Иммунофлуоресцентное мечение/микроскопия макрофагов BAL

ПРИМЕЧАНИЕ: Ячейки приклеиваются к покровным стеклам, как упоминалось выше.

1. Удалите питательную среду и промойте клетки один раз фосфатно-солевым буфером (PBS). Зафиксируйте клетки в 2% фиксаторе параформальдегида/периодата/лизина (PLP) в течение 10 минут.
2. Кратковременно промойте клетки в PBS, а затем проникните в 0,2% Tween 20 в PBS в течение 20 минут.
3. Блокируют клетки с 10% куриной сывороткой в 5% бычьем сывороточном альбумине (БСА), разведенным в PBS в течение 30 мин.
4. Инкубировать с первичными и контрольными антителами изотипа в течение 1 ч при комнатной температуре при концентрации 1:100 (более подробная информация приведена в Таблице материалов) при 37 °С.<бр/> заметка: Для образцов BAL специфический маркер макрофагов обычно не требуется.
5. После добавления первичных антител промыть клетки в PBS, и далее инкубировать с соответствующими вторичными антителами в течение 40 мин при комнатной температуре.
6. Промойте срезы в PBS и установите монтажную среду на основе DAPI для визуализации с помощью конфокального микроскопа (как упоминалось выше) при лазерных возбуждениях 405, 488, 561 и 647 нм и масляном объективе 40X, 1.0 NA.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Человеческие образцы: первичные антитела
Кролик античеловеческий H3Cit (Цитруллин R26)	Абкам	АБ5103	10 мкг/мл
Мышь античеловеческая MMP9	Новус Биджиал	AB119906	1:200 асцит, концентрация не дана
Кролик против человека PADI2/PAD2	Абкам	AB16478	7 мкг/мл
Мышиный античеловеческий PADI4/PAD4	Абкам	AB128086	10,1 мкг/мл
Вторичные антитела
Курица против кролика AF 488/	Технологии жизни	А-21441
Куриный антикролик AF 594	Технологии жизни	А-21442
Куриный антикозий AF 594	Технологии жизни	А-21468
Антимышечный анти-мышь AF488	Технологии жизни	А-21200
Программное обеспечение
Имарис	Битовая плоскость
Изображение J	НИЗ
Для усреднения интенсивности флуорфоров можно использовать стандартное офисное приложение, такое как Microsoft Excel
Микроскопы
Конфокальный сканирующий микроскоп C1	Компания Nikon
FV1200 Конфокальный сканирующий микроскоп	Олимп
Образцы BAL человека из бронхоскопического отделения в медицинском центре Монаш
медиа
РПМИ	Сигма-Олдрич	Р8758
Эмбриональная сыворотка для теленка	Сигма-Олдрич	Ф0926
L-глютамин	Сигма-Олдрич	Г7513
Другие реагенты
параформальдегид/периодат/лизин (PLP) фиксатор	Сигма-Олдрич	No 27387
Натуральный формалин	Сигма-Олдрич	42904
Покровные стекла 12 мл	Сигма-Олдрич	С1815
Покровные стекла 60 x 24 мл	Сигма-Олдрич	С6875