1. Распыление инокуляции суспензией M. grisea Conidia
- Грибковая культура для M.grisea
- Подготовьте питательную среду для овсяных хлопьев томатного агара (ОТА) на грибковые штаммы.
- Взвесьте 30 - 50 г овсяных хлопьев, добавьте их в 800 мл дистиллированной/деионизированной воды (ddH2O) и кипятите смесь в течение 30 минут в электрической кастрюле.
- Процедите кипяченый овсяный сок в стакан через кусочек марли.
- Добавьте 150 мл томатного сока и 20 г агара к фильтрату в стакане и добавьте ddH2O до 1 000 мл.
- Подготовка экспериментальных материалов
- Замочите около 50 семян риса (Oryza sativa) сорта Lijiangxintuan-heigu (LTH) в ddH2O на 3 дня или замочите около 50 семян ячменя (Hordeum vulgare cv Golden Promise) в ddH2O примерно на 1 день.
- Заверните семена риса или ячменя во влажную марлю и прорастите их на влажной фильтровальной бумаге примерно в 30 чашках Петри диаметром 10 см х 10 см при температуре 28 °C. Время прорастания семян риса составляет около 2 - 3 дней, а семян ячменя - около 2 дней. Относительная влажность воздуха в теплице составляет примерно 70%.
- Высадите рассаду риса или ячменя в горшки, используя автоклавную почву и половку, а затем накройте ее слоем вермикулита.
- Поместите растения в подходящую теплицу или шкаф для выращивания при температуре 25 °C примерно на 1 ~ 2 недели.
- Стерильными хирургическими ножницами разрежьте на круги 3 слоя фильтровальной бумаги (каждый круг должен иметь диаметр 8 см) и поместите их на 100 мм стерильные пластиковые пластины.
- Добавьте ddH2O в каждую посуду, чтобы пропитать фильтровальную бумагу.
- Убедитесь, что фильтровальная бумага полностью влажная, но не добавляйте дополнительную воду.
- Удалите лишнюю воду с помощью вакуумного насоса.
- Поместите 2 стерильные зубочистки в чашку для культивирования, чтобы они поддерживали листья риса/ячменя; расстояние между зубочистками ~2 - 3 см друг от друга.
- Соберите листья риса через 2 недели после посева семян или возьмите листья ячменя через 7 дней после посева семян.
- Используя проростки риса/ячменя с 4-6 листьями, срежьте нижнюю часть стебля на расстоянии ~5 см от верхушки и соберите листья.
- Протокол инокуляции распылением
- Культивировать штамм гриба на планшетах OTA в термостатическом инкубаторе (25 °C) в течение ~4 дней.
- Добавьте ~2 мл ddH2O с помощью пипетки объемом 0,5–5 мл в каждую 4-дневную пластину.
- С помощью петли инокуляции соскребите мицелий штамма M. grisea дикого типа и мутантного штамма в остатки мицелия.
- Соберите остатки мицелия и перенесите их на новую ОТА-планшет. Возьмите остатки мицелия и высушите феном на чистой скамейке.
- Накройте плиту 3 слоями марли, чтобы обеспечить необходимую для роста конидий влажность в теплице при температуре 25 °C днем (14 часов) и 23 °C ночью (10 часов) в течение 24 - 48 часов.
- Добавьте по 2 мл ddH2O в каждую посуду и аккуратно соскребите конидии стерильными ватными тампонами с последующей фильтрацией через 2 слоя линзовой бумаги. Будьте осторожны, чтобы не поцарапать поверхность питательной среды.
- Переложите суспензию конидий в новую пробирку объемом 50 мл с помощью пипетки объемом 100–1 000 мкл.
- Центрифугируйте в течение 5 мин при температуре не менее 5 000 x g при 25 °C.
- Удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу до получения 2 x 104 конидии на мл в 0,025% (v/v) растворе Tween-20. Раствор Tween-20 обычно составляет около 10 - 20 мл.
- Залейте споровую суспензию в ручной распылитель.
- Распылите около 10 мл конидиальной суспензии на рисовые листья 2-недельных проростков риса или листья ячменя 7-дневных проростков ячменя и инкубируйте их при 25 °C в темной влажной камере в течение ~24 ч. Опрыскайте контрольные растения 0,025% (v/v) раствором Tween-20.
- Перенесите листья в другую влажную камеру под флуоресцентным светом при температуре 25 °C на фотопериод 12 часов.
- Запишите симптомы заболевания через 5 дней после прививки. Осмотрите больные стебли риса/ячменя длиной ~6 см. Стандарт оценки соответствует системе оценки взрывостойкости Международного научно-исследовательского института риса (IRRI). Подробная информация о системе надрезов для взрывостойкости приведена в таблице 1.
- Сфотографируйте листья, чтобы оценить зараженность тестируемых штаммов. Инфекцию оценивали по количеству очагов поражения на 3,6 см2 .
Таблица 1: Система оценки взрывостойкости. Таблица приведена по материалам Международного научно-исследовательского института риса (IRRI).
| шкала | описание |
| 1 | Мелкие коричневые пятнышки ювелирного размера |
| 2 | Мелкие округлые или слегка вытянутые, некротические серые пятна, около 1-2 мм в диаметре, с отчетливой коричневой каймой. Поражения в основном обнаруживаются на верхних листьях |
| 3 | Тип поражения такой же, как и у 2, но значительное количество поражений приходится на верхние листья |
| 4 | Типичные восприимчивые бластные поражения размером 3 мм и более, поражающие менее 4% площади листа |
| 5 | Типичные восприимчивые бластные поражения, размером 3 мм и более, поражающие менее 4-10% площади листа |
| 6 | Типичные восприимчивые бластные поражения, размером 3 мм и более, поражающие менее 11-25% площади листа |
| 7 | Типичные восприимчивые бластные поражения, размером 3 мм и более, поражающие менее 26-50% площади листа |
| 8 | Типичные восприимчивые бластные поражения, размером 3 мм и более, поражающие менее 51-75% площади листьев, многие листья отмершие |
| 9 | Типичные восприимчивые бластные поражения, размером 3 мм и более, поражают более 75% площади листа |
