1. Грибковая культура для M.grisea
- Подготовьте питательную среду для овсяных хлопьев томатного агара (ОТА) на грибковые штаммы.
- Взвесьте 30 - 50 г овсяных хлопьев, добавьте их в 800 мл дистиллированной/деионизированной воды (ddH2O) и кипятите смесь в течение 30 минут в электрической кастрюле.
- Процедите кипяченый овсяный сок в стакан через кусочек марли.
- Добавьте 150 мл томатного сока и 20 г агара к фильтрату в стакане и добавьте ddH2O до 1 000 мл.
2. Подготовка экспериментальных материалов
- Замочите около 50 семян риса (Oryza sativa) сорта Lijiangxintuan-heigu (LTH) в ddH2O на 3 дня или замочите около 50 семян ячменя (Hordeum vulgare cv Golden Promise) в ddH2O примерно на 1 день.
- Заверните семена риса или ячменя во влажную марлю и прорастите их на влажной фильтровальной бумаге примерно в 30 чашках Петри диаметром 10 см х 10 см при температуре 28 °C. Время прорастания семян риса составляет около 2 - 3 дней, а семян ячменя - около 2 дней. Относительная влажность воздуха в теплице составляет примерно 70%.
- Высадите рассаду риса или ячменя в горшки, используя автоклавную почву и половку, а затем накройте ее слоем вермикулита.
- Поместите растения в подходящую теплицу или шкаф для выращивания при температуре 25 °C примерно на 1 ~ 2 недели.
- Стерильными хирургическими ножницами разрежьте на круги 3 слоя фильтровальной бумаги (каждый круг должен иметь диаметр 8 см) и поместите их на 100 мм стерильные пластиковые пластины.
- Добавьте ddH2O в каждую посуду, чтобы пропитать фильтровальную бумагу.
- Убедитесь, что фильтровальная бумага полностью влажная, но не добавляйте дополнительную воду.
- Удалите лишнюю воду с помощью вакуумного насоса.
- Поместите 2 стерильные зубочистки в чашку для культивирования, чтобы они поддерживали листья риса/ячменя; расстояние между зубочистками ~2 - 3 см друг от друга.
- Соберите листья риса через 2 недели после посева семян или возьмите листья ячменя через 7 дней после посева семян.
- Используя проростки риса/ячменя с 4-6 листьями, срежьте нижнюю часть стебля на расстоянии ~5 см от верхушки и соберите листья.
3. Инокуляция ран кубиками мицелия или каплями конидиальной суспензии M. grisea
- С помощью анатомической иглы соскребите три раны длиной 2-3 см в основных жилках отделившихся листьев риса/ячменя, стараясь не проникнуть внутрь листьев.
- Положите очищенные листья на зубочистки и распылите на листья 0,02% раствор Tween-20, чтобы образовался слой капель.
- Вырежьте мицелиальную пробку размером 0,5 см x 0,5 см для каждого штамма M. grisea (дикого типа, мутантных, комплементных штаммов или других тестовых штаммов) с планшета OTA.
- Поместите мицелиальные пробки или капли конидиальной суспензии объемом 25 мкл на раненые листья и инкубируйте листья при температуре 25 °C во влажной камере в течение 3 - 8 дней.
- Осмотрите очаги поражения через 5 - 7 дней после прививки. Метод обследования такой же, как и при использовании аэрозольного метода инокуляции (см. шаг 1.3.13).
- Осмотрите пораженные стебли риса/ячменя длиной ~6 см и сфотографируйте их, чтобы оценить зараженность тестируемых сортов. Инфекцию оценивали по количеству очагов поражения на 3,6 см2 .
