1. Производство рекомбинантного HBV, кодирующего репортерный белок
- Получение клеток HepG2
- Готовят питательную среду для клеточных клеток (модифицированную среду Дульбекко или DMEM) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 100 Ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и 100 Ед/мл заменимых аминокислот).
- Планшет 4 x 106 клеток HepG2 в 10-сантиметровой чашке, покрытой коллагеном, в 10 мл питательной среды за день до трансфекции. Инкубировать клетки HepG2 при 37 °C в увлажненном инкубаторе с 5% содержаниемCO2.
заметка: Когда примерно 4 x 106 клеток HepG2 помещают в 10-сантиметровую чашку, покрытую коллагеном, в 10 мл питательной среды, они будут на 70-90% сливаться на следующий день.
- Трансфекция
- Трансфектируйте клетки HepG2 5 мкг дельта-эпсилона pUC1.2HBV (вирус гепатита В) и 5 мкг pUC1.2HBV/NL15 с использованием реагента для трансфекции в соответствии с инструкциями производителя.
- На следующий день удалите питательную среду и добавьте 10 мл свежей питательной среды.
- Через неделю после трансфекции перенесите питательную среду, содержащую рекомбинантный HBV, в пробирку объемом 50 мл и перейдите к шагу 1.3.1. Добавьте 10 мл свежей питательной среды в планшет, содержащий трансфицированные клетки><.
заметка: Производство рекомбинантного HBV поддерживается в течение 4 недель. Питательная среда, содержащая рекомбинантный HBV, может храниться при температуре 4 °C в течение 1 месяца.
- Очистка рекомбинантного HBV
- Удалить клеточный мусор из питательной среды, содержащей рекомбинантный HBV, путем центрифугирования (2300 x g в течение 5 мин).
- Пропустите надосадочную жидкость через мембранный фильтр 0,45 мкм.
- Добавьте равный объем 26% ПЭГ/1,5 М NaCl (полиэтиленгликоль 6000: 130 г, NaCl, 49 г, 1 мл 0,5 М ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота) pH 8,0 и 5 мл 1 М HEPES (4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинетансульфоновая кислота) (pH 7,6 в 500 мл) в питательную среду, содержащую рекомбинантный HBV, и аккуратно перемешайте. Выдерживать в течение ночи при температуре 4 °C.
- Центрифуга при давлении 2 300 x g в течение 20 мин при 4 °C.
- Выбросьте надосадочную жидкость и растворите гранулу в 0,5 мл TNE (10 мМ Tris (трис(гидроксиметил)аминометан), 50 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА).
- Удалите мусор центрифугированием при давлении 2 300 x g в течение 5 минут.
- Загрузите 0,5 мл TNE, содержащего рекомбинантный HBV, в 0,8 мл 20% сахарозы в TNE.
- Центрифуга при 100 000 × г в течение 3 часов при 15 °C.
- Выбросьте как можно больше надосадочной жидкости и сохраните гранулы. Повторно суспендируйте его в 1 мл бессывороточного DMEM на 40 мл исходной питательной среды.
- Выдерживать в течение ночи при температуре 4 °C.
- Профильтруйте через фильтр 0,45 мкм. Приготовьте 0,5 мл аликвот и храните при температуре -80 °C.
заметка: Если наблюдается контаминация репортерного белка исходного образца вируса, очистите вирус путем ультрацентрифугирования с градиентом плотности 5-30% сахарозы в TNE при 100 000 x g в течение 2 часов или центрифугированием с уравновешенной плотностью CsCl с 1,1-1,6 г/мл при 150 000 x g в течение 50 часов.
2. Инфекция рекомбинантного HBV
- Культивирование клеток HepG2, стабильно экспрессирующих NTCP (полипептид таурохолата натрия) (HepG2/NTCP), чувствительных к инфекции HBV, в DMEM с добавлением 10% FBS, 100 ЕД/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 250 мкг/мл G-418 (генетикина) и 100 ЕД/мл заменимых аминокислот при 37 °С в увлажненном инкубаторе с 5% содержаниемCO2.
- За сутки до инфекции поместите примерно 5 x 104 клеток HepG2/NTCP в 96-луночную пластину, покрытую коллагеновой оболочкой, в 0,1 мл питательной среды.
- Разморозьте рекомбинантный HBV на водяной бане при температуре 37 °C до тех пор, пока во флаконе не не останется небольшое количество льда.
- Подготовьте среду к заражению, смешав следующее:10 мкл 40% PEG8000 в 1x фосфатно-солевом буфере (PBS), 2 мкл диметилсульфоксида (ДМСО), 10 мкл рекомбинантного HBV и 78 мкл свежей питательной среды на лунку 96-луночного планшета.
- Добавьте 100 мкл рекомбинантного раствора HBV в одну лунку 96-луночного планшета.
- Через сутки после заражения 3 раза промойте инфицированные клетки 300 мкл PBS на лунку, чтобы удалить загрязняющий репортерный белок из вирусной фракции.
- Инкубировать инфицированные клетки в 200 мкл питательной среды, содержащей 2% ДМСО, в течение одной недели или менее.
3. Анализ
- Через неделю после заражения промойте инфицированные клетки 3 раза PBS.
- Добавьте к инфицированным клеткам 50 μл буфера для лизиса.
- Покачивайте питательную пластину в течение 5 минут, а затем центрифугируйте при давлении 2 000 x g в течение 5 минут.
- Добавьте 50 μл репортерной подложки в пластину люминометра.
- Добавьте 20 мкл клеточного лизата в люминометическую пластину, содержащую репортерную подложку. Перемешайте, немного вортексировав.
- Поместите пластину в люминометр и начните считывание показаний.
