Все процедуры, связанные с животными моделями, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE
1. Требуемые решения
- Приготовьте 150 мг/л (для анестезии) или 300 мг/л (для эвтаназии) раствор этил3-аминобензоата метансульфоната (MS-222) с водой из аквариума, где содержатся рыбки данио. Наполните небольшой резервуар 1 л раствора анестетика и держите его аэрированным.
- Наполните еще один небольшой аквариум 1 л аквариумной воды без MS-222 для восстановления рыб и поддерживайте ее в воздухе.
- Приготовьте 50 мл 1x PBS из 10x стерильного исходного раствора.
- Для цитометрического анализа/выделения клеток кишечника приготовьте достаточное количество свежего 0,15% раствора коллагеназы типа IV в количестве 1 мл на рыбу из исходного раствора или из порошка в модифицированной среде Дульбекко (DMEM) с 1% v/v пенициллином и стрептомицином (см. материалы). Сделайте аликвоты (1 на рыбу) по 1 мл в центрифужных пробирках объемом 2 мл. Держите при температуре 4 °C до 30 минут до этапа вскрытия.
- Для конфокальной микроскопии/фиксации образца приготовьте 50 мл свежего 4% раствора параформальдегида (PFA) в PBS или разморозьте исходный раствор из морозильной камеры при температуре -20 °C в вытяжном шкафу><.
осторожность: ПФА токсичен. Пожалуйста, прочтите паспорт безопасности материала перед началом работы с ним. Следует надевать перчатки и защитные очки, а также всегда оставлять растворы внутри вытяжного шкафа.
2. Подготовка оборудования к оральной интубации
- Поместите примерно 1 см тонкой силиконовой трубки на иглу с люэровским замком плотностью 31 G, чтобы покрыть кончик иглы.
- Отрежьте стерильный наконечник пипетки объемом 10 мкл (около 2 см), возьмите более тонкий конец и поместите его на силиконовую трубку в качестве оболочки. Убедитесь, что пипетка выходит за пределы кончика иглы, чтобы не поранить животное.
- Присоедините иглу к шприцу со замком Люэра объемом 100 μл.
заметка: Всегда тщательно промывайте этанолом, а затем фосфатно-солевым буфером (PBS, см. раздел «Материалы») между процедурами.
3. Приготовление суспензии флуоресцентных наночастиц
- Пометьте белковую наночастицу эфиром Atto-488 NHS (см. Таблицу материалов) или подходящим флуоресцентным красителем в соответствии с инструкциями производителя.
- Ресуспендируйте наночастицы в 0,1 М буфере бикарбоната натрия в концентрации 2 мг/мл.
- Растворите эфир Atto 488 NHS в безаминовом диметилсульфоксиде (ДМСО) в концентрации 2 мг/мл. Сохраняйте аликвоту 10 μл, чтобы проверить эффективность маркировки.
- Смешайте наночастицы и эфир Atto 488 NHS в молярном соотношении 1:2 (белок: краситель), перемешивая в темноте.
- Открутите меченые наночастицы путем центрифугирования при давлении 8000 x g в течение 10 минут при комнатной температуре, удалите надосадочную жидкость и оставьте ее для проверки эффективности мечения.
- Промойте меченые наночастицы, повторно суспендируя их в 1 мл 0,1 М буфера бикарбоната натрия путем вортексирования и пипетирования вверх и вниз. Затем надосадочную жидкость отбрасывают центрифугированием при температуре 8000 x g в течение 10 мин при комнатной температуре. Повторите шаг 3.6 5 раз.
- Ресуспендируйте гранулу в 5 мл 0,1 М буфера бикарбоната натрия в центрифужной пробирке объемом 15 мл и изготовьте аликвоты флуоресцентной наночастицы в центрифужных пробирках объемом 1,5 мл (30 аликвот). Уменьшите при температуре 8 000 x g в течение 10 минут при комнатной температуре, выбросьте надосадочную жидкость и храните при температуре -80 °C в защищенном от света месте.
4. Анестезия рыбок данио и оральная интубация
- Голодайте на рыбе (>0,5 г) не менее чем за 48 часов до эксперимента, чтобы опорожнить кишечник.
- Переместите рыб (12 рыб) в экспериментальные резервуары (6 л) за одну ночь до эксперимента, чтобы обеспечить акклиматизацию12.
Хорошо переведите - раствор наночастиц (например, 2500 об/мин и 30 с) и наберите желаемый объем суспензии наночастиц (например, 20–50 мкл) в шприц, прикрепленный к защищаемой игле.
- Поместите рыб в аэрированный раствор MS-222 с концентрацией 150 мг/л (см. раздел 1) до тех пор, пока они не опустятся на дно аквариума и не перестанут реагировать на сжатие хвостового плавника; этот процесс занимает менее 5 минут.
- Быстро переложите обезболенных рыбок с помощью сачка во влажный пластиковый лоток, ориентируйте животное горизонтально лицом к игле и сразу же приступайте к оральной интубации.
- Осторожно поддержите рыбу одной рукой и откройте рот другой рукой с помощью защищенной иглы. Осторожно введите иглу вниз по пищеводу примерно на 1 см от ротового отверстия.
заметка: Оператор может почувствовать небольшое сопротивление, когда конец наконечника пипетки пройдет через жабры. Следите за тем, чтобы не наклонить вход иглы слишком сильно, что может привести к перфорации жабры.
- Медленно вводите суспензию наночастиц в рыбу. Следите за тем, чтобы суспензия не вытекала наружу через жабры или рот.
- Аккуратно извлеките иглу и поместите рыб в резервуар для восстановления (см. раздел 1). Восстановление обычно занимает 1 минуту.
- Внимательно проверьте рыбу на наличие каких-либо отклонений от нормы (например, кровотечение в жабрах является признаком перфорации).
- Как только рыбы восстановятся, верните их в экспериментальные емкости.
