$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Обезболивать, интубировать и инокулировать животных
ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуются специфические иммунокомпетентные самцы крыс Sprague-Dawley без патогенов (SPF) весом 100 - 120 г. Обеспечьте всех животных пищей и водой в неограниченном количестве и размещайте их в общественных местах на древесной щепе или другой впитывающей подстилке со стандартными 12-часовыми циклами «свет-темнота».
- Перед проведением каких-либо экспериментов приобретите и простерилизуйте металлическую канюлю и полиэтиленовую трубку подходящего размера для данного вида животного. Приобретите стерильные одноразовые шприцы объемом 1 мл и стерильные одноразовые иглы 25 калибра.
осторожность: Всегда выбрасывайте эти шприцы и иглы в контейнер для острых предметов.
- Для крыс приобретите или изготовьте металлическую канюлю длиной около 12 см, с внутренним диаметром 0,9 - 1,0 мм и наружным диаметром 1,0 - 1,2 мм и изогнутой под углом примерно 45° на одном конце. Отрежьте полиэтиленовую трубку длиной от 11 до 12 дюймов с внутренним диаметром 0,4 мм и наружным диаметром 0,8 мм. (См. Рисунок 1A).
- Поместите металлическую канюлю в стеклянную трубку с завинчивающейся крышкой и проведите автоклав стандартными методами стерилизации. Замочите и храните отрезанные отрезки полиэтиленовой трубки в закрытом стакане, содержащем спирт.
- Подготовьте рабочую поверхность и устройство для интубации.
- Положите чистый одноразовый коврик на рабочую поверхность, рядом с водяной баней. Перенесите металлическую канюлю в стеклянной трубке для хранения на эту поверхность. Снимите колпачок с накопительной трубки и сдвиньте конец канюли с «ручкой» к открытому концу трубки.
- С помощью стерильных щипцов извлеките одну длину полиэтиленовой трубки из стакана и вставьте ее через внутреннюю часть стерильной металлической канюли, убедившись, что она свободно движется. Установите стерильную одноразовую иглу 25-го калибра (для крыс) на свободный конец полиэтиленовой трубки, вставив иглу на несколько мм внутрь трубки. (См. Рисунок 1А для крыс).
- Поместите направляющие метки как на металлическую канюлю, так и на полиэтиленовую трубку, чтобы указать глубину введения в организм животного, следуя процедуре интубации, описанной ниже, на одном усыпленном животном. Откройте грудную полость для осмотра, затем правильно установите металлическую канюлю и соответствующим образом продвинуте полиэтиленовую трубку. С помощью несмываемой ручки отметьте металлическую канюлю там, где она встречается со ртом животного, и полиэтиленовую трубку там, где она встречается с верхней частью металлической канюли, чтобы помочь правильно разместить остальных животных.
- В вытяжном шкафу (или с помощью соответствующей системы очистки) обезболивайте до 6 животных одновременно в закрытой камере, снабженной ≤5% изофлураном в дозе кислорода 1,5 л/мин до тех пор, пока рвотный рефлекс не будет подавлен (примерно на 1 минуту).
заметка: Перед проведением любых экспериментов необходимо установить безопасную дозу и время экспозиции изофлурана в конкретных используемых условиях (например, размер/тип камеры и размер/вид/штамм животного) для предотвращения непреднамеренного смертельного воздействия.
- Наполните стерильный одноразовый шприц объемом 1 мл (для крыс) стерильным физиологическим раствором, поместив стерильный наконечник в физиологический раствор и потянув его назад на поршне. Прикрепите шприц к игле, установленной на полиэтиленовой трубке, и промойте весь объем физиологического раствора через трубку до тех пор, пока шприц не опустеет.
- Наполните шприц инокулюмом на основе агара из контейнера на водяной бане и промойте агар через трубку до тех пор, пока трубка не будет заполнена (т.е. полностью заполнена агаром).
- Для крыс извлеките иглу 25-го калибра (установленную на полиэтиленовой трубке) из одноразового шприца. Выбросьте использованный шприц в контейнер для острых предметов. Наполните новый, стерильный одноразовый шприц объемом 1 мл инокулюмом на основе агара из контейнера на водяной бане, поместив стерильный наконечник в инокулюм и потянув назад за поршень. Снова прикрепите иглу (установленную на полиэтиленовой трубке) и промывайте агар через трубку, нажимая на поршень до тех пор, пока трубка полностью не заполнится агаром.
- Извлеките одно животное из анестезирующей камеры. Положите животное в лежачем положении на одноразовый коврик головой вправо и хвостом влево, как показано на рисунке 1В.
- С помощью интубационного устройства (т.е. металлической канюли, оснащенной полиэтиленовой трубкой) интубируйте животное и введите канюлю в большую долю левого легкого (см. рисунок 1D).
- Вставьте свободный конец металлической канюли в рот животного. Поверните канюлю так, чтобы свободный конец был наклонен вверх и аккуратно продвигайте ее в трахею, осторожно обходя гортанные структуры легким скручивающим движением. Подтвердите введение в трахею, а не в пищевод, осторожно скользя канюлей немного вперед и назад несколько раз, пальпируя кольца трахеи указательным пальцем левой руки, как показано на рисунке 1C.
- Когда канюля достигнет бифуркации, где трахея разделяется на левый и правый бронхи, сделайте легкое вращающее движение в левую сторону животного, чтобы убедиться, что канюля вставлена в левый бронх. Продвигайте металлическую канюлю до конца на полпути на три четверти вниз по левому легкому, используя ранее установленную направляющую метку, чтобы подтвердить, что достигнута соответствующая глубина.
- Установив металлическую канюлю, продвиньте полиэтиленовую трубку вперед на несколько мм. Используйте ранее размещенную направляющую метку на трубке, чтобы убедиться, что она продвинута только настолько, чтобы выйти из конца металлической канюли и не проколоть легкое.
- Когда обе канюли установлены, с помощью прилагаемого шприца введите 100 мкл (для крыс) агаровой суспензии глубоко в большую долю левого легкого (см. рисунок 1D). Извлеките несколько мм полиэтиленовой трубки, а затем аккуратно снимите неповрежденное интубационное устройство. Поместите его обратно в стеклянную трубку для хранения и переместите животное в новую клетку, чтобы оно восстановилось.
