Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Приготовление экстракта слезной железы
ПРИМЕЧАНИЕ: Крысы подвергались обезболиванию внутрибрюшинной инъекцией кетамина (75 мг/кг) и ксилазина (10 мг/кг). Надлежащая анестезия подтверждалась защемлением пальцев ног и хвоста. Офтальмологический гель наносился на глаза крысы для предотвращения сухости после каждой процедуры. Крыс под наркозом помещали под дальний инфракрасный свет, чтобы животные оставались в тепле до полного выздоровления. Во время процедур и во время восстановления животные находились под пристальным наблюдением исследователей. Все материалы и хирургические инструменты были стерильны перед использованием. В конце эксперимента крыс усыпляли путем внутрибрюшинной инъекции пентобарбитала (80 мг/кг). Полная эвтаназия была подтверждена отсутствием сердечного пульса и отсутствием рефлекса моргания при прикосновении к глазному яблоку. Крысы содержались в стандартных условиях: комнатная температура, 21-23 °С; относительная влажность воздуха, 30-70%; Цикл светло-темноте, чередующийся 12 ч (с 7 утра до 7 вечера).
- Поместите усыпленных самок крыс Спрэг-Доули (возраст от 8 до 16 недель) плашмя, одним ухом к столу, а другим вверх. Сделайте 10-миллиметровый разрез вверху-снизу под открытым ухом с помощью пружинных ножниц. Удалите слезную железу, рассекая ее от окружающей соединительной ткани и от дренажного протока.
- Храните сальники при температуре -80 °C до тех пор, пока это не потребуется. Разморозьте железы на льду. Как можно мельче пропустите через мясорубку на льду с помощью ножниц. Добавьте 150 мкл PBS с 1x ингибитором протеазы на слезную железу.
- Ультразвуковая обработка образцов на льду в течение 5 мин при частоте 20 кГц при включенном ультразвуковом аппарате 10 с и выключенном 10 с при амплитуде 30%. Центрифугируйте обработанные ультразвуком образцы в течение 20 минут при 13 000 x g и 4 °C.
- Пипеткой нажмите надосадочную жидкость и переложите ее в новую пробирку. Нанесите надосадочную жидкость в пробирки объемом 1,5 мл и храните при температуре -80 °C. Измерьте концентрацию белка с помощью анализа на бицинхониновую кислоту в соответствии с инструкциями производителя.
2. Приготовление эмульсии и коклюшного токсина
- эмульсия
- Добавьте 40 мг убитой при нагревании Mycobacterium tuberculosis H37Ra в 10 мл полного адъюванта Фрейнда, содержащего 1 мг/мл Mycobacterium tuberculosis H37Ra и хорошо перемешайте.
заметка: Конечный полный адъювант Фрейнда содержит 5 мг/мл Mycobacterium tuberculosis H37Ra.
- Взвесьте овальбумин, растворите его в PBS и приготовьте антигенную смесь, содержащую 2 мг/мл овальбумина и 10 мг/мл экстракта слезной железы. Стремясь к объему впрыска 200 мкл для каждого животного, приготовьте мастер-смесь на основе количества животных.
- Перенесите неполный адъювант Фройнда или полный адъювант Фройнда в пробирку объемом 50 мл, следя за тем, чтобы объем адъюванта к смеси антигена находился в соотношении 1:1. Добавляйте антигенную смесь по каплям в адъювант во время завихрения с максимальной скоростью, чтобы не привести к рассыпанию. Продолжайте вортекс в течение 5 минут после того, как весь антиген будет добавлен
.
- Перенесите эмульсию в шприц объемом 5 мл и соедините его с другим шприцем объемом 5 мл через соединитель шприца. Протолкните эмульсию из одного шприца в другой, чтобы перемешать ее.
заметка: Эмульсия готова, если при помещении в воду остается одна капля в виде сферы. Следует использовать только свежеприготовленную эмульсию или эмульсию, хранящуюся в течение ночи при температуре 4 °C.
- Коклюшный токсин
- Восстановите 50 г коклюшного токсина в 500 мл воды, чтобы получить конечную концентрацию 100 нг/л. Проголосуйте в контейнере в течение 30 секунд, чтобы убедиться, что токсин полностью растворился><.
заметка: Не стерилизуйте фильтрацией, так как это приведет к потере материала. Не замораживайте. Этот раствор остается активным не менее 6 месяцев при 4 °C.
- Развести 100 нг/мкл коклюшного токсина до 3 нг/мкл с помощью PBS. Перенесите 100 мкл разведенного коклюшного токсина в инъекционный шприц с люэровским замком объемом 1 мл с помощью иглы 27 G.
3. Иммунизация крыс Льюиса
- В день 0 перемешайте эмульсию несколько раз. Распределите 200 мкл эмульсии, содержащей 1 мг экстракта слезных желез и 200 мкг овальбумина в полном адъюванте Фрейнда, в 1 мл люэровских шприцев с иглами 27G. Введите эмульсию подкожно у основания крысиных хвостов без анестезии.
заметка: Хвост не нужно предварительно прогревать перед уколом. Каждой крысе иммунизируют 1 мг экстракта слезных желез и 200 мкг овальбумина в полном адъюванте Фрейнда с 500 мкг Mycobacterium tuberculosis H37Ra.
- На 14-й день вводят 200 мкл эмульсии, содержащей 1 мг экстракта слезных желез и 200 мкг овальбумина в неполном адъюванте Фрейнда, так же, как и в 0-й день. Введите 300 г коклюшного токсина в 100 мкл PBS внутрибрюшинно каждой крысе в тот же день.
4. Инъекция антигенной смеси в подконъюнктиву и слезную железу для привлечения антиген-специфических иммунных клеток и вызова местного воспаления
- Рассчитайте количество овальбумина и экстракта слезной железы исходя из количества крыс в эксперименте. Взвесьте необходимое количество овальбумина и соедините его с размороженным экстрактом слезной железы, приготовленным на шаге 1, получив антигенный раствор, содержащий 1 мг/мл овальбумина и 1 мг/мл экстракта слезной железы.
- Обезболивайте крыс кетамином (75 мг/кг) и ксилазином (10 мг/кг) путем внутрибрюшинного введения. Ущипните пальцы ног крыс, чтобы убедиться в том, что была достигнута надлежащая анестезия (т.е. после ущипывания не наблюдается никаких ответных движений). Введите 5 мкл антигена в форницеальную субконъюнктиву глаза. Введите 20 мкл антигена в слезную железу.
