Количественная Когнитивные Уменьшает причиненный Черепно Лучевая терапия

Краткое содержание

Когнитивные нарушения, возникающие в результате радиотерапевтического лечения опухолей головного мозга, представляют собой клинически трудноизлечимое состояние, которое отрицательно сказывается на качестве жизни. Возможность критической оценки потенциальных методов коррекции радиационно-индуцированного снижения когнитивных функций в конечном итоге зависит от способности проводить строгие количественные оценки когнитивных способностей.

Аннотация

За исключением выживаемости, когнитивные нарушения, возникающие в результате клинического лечения рака, являются основным фактором, определяющим терапевтический результат. Для многих пациентов с новообразованиями ЦНС и вне ЦНС лучевая и химиотерапия являются наиболее эффективными методами контроля заболевания. Однако такое лечение имеет свою цену, и почти все выжившие после рака (~11 миллионов человек только в США по состоянию на 2006 год) подвержены риску развития когнитивной дисфункции, при этом наиболее тяжелые случаи наблюдаются у пациентов, прошедших краниальную лучевую терапию (~200 000 человек в год) для контроля первичных и метастатических опухолей головного мозга¹. Особо проблемными являются педиатрические случаи, когда долгосрочная выживаемость, сопровождаемая выраженным снижением когнитивных функций, приводит к значительному социально-экономическому бремени². На сегодняшний день удовлетворительных решений этой серьезной клинической проблемы все еще не существует.

Мы подошли к решению этой серьезной проблемы здравоохранения, используя трансплантацию стволовых клеток для борьбы с радиационным когнитивным снижением у атимических крыс, подвергнутых краниальному облучению³. Подробную информацию о стереотаксическом облучении, а также о культивировании in vitro и трансплантации нейральных стволовых клеток человека (hNSCs) можно найти в нашей сопутствующей статье (Acharya et al., ссылка JoVE). После облучения и операции по трансплантации у крыс оценивают изменения когнитивных функций, выживаемость приживленных клеток и экспрессию маркеров специфической дифференцировки через 1 и 4 месяца после облучения. Для критической оценки успеха или неудачи любого потенциального вмешательства, направленного на смягчение радиационных когнитивных последствий, должна быть проведена серия строгих количественных когнитивных тестов. Для этого мы подвергаем животных набору парадигм когнитивного тестирования, включая распознавание нового места, водный лабиринт, приподнятый крестообразный лабиринт и выработку условного рефлекса страха, чтобы количественно оценить гиппокампальное и негиппокампальное обучение и память. Мы продемонстрировали эффективность этих тестов для количественной оценки специфических типов когнитивного дефицита у облученных животных и использовали их, чтобы показать, что животные с имплантированными hNSCs демонстрируют значительное улучшение когнитивных функций³.

Когнитивные преимущества, полученные в результате трансплантации стволовых клеток человека, позволяют предположить, что подобные стратегии в будущем могут стать необходимым клиническим средством помощи выжившим после рака пациентам, страдающим когнитивными нарушениями. В связи с этим мы представили письменную и визуальную документацию по критическим этапам наших парадигм когнитивного тестирования, чтобы способствовать внедрению наших многообещающих результатов в клиническую практику.

Протокол

Схемы наших парадигм когнитивного тестирования представлены на Рисунке 1. Когнитивное тестирование начинается через один месяц после облучения и проведения хирургических процедур.

Проведение теста на распознавание нового места (NPR)

1. Задача на распознавание нового места (Novel Place Recognition, NPR) основана на процедурах, описанных Мамби и коллегами (2002), и представляет собой задачу на пространственную распознавательную память, которая зависит от работы гиппокампа⁴.
2. Сначала крыс приучают к контексту тестирования, помещая их в арены для тестирования (специально изготовленные белые акриловые ящики с открытым верхом, 70cm X 70cm X 40cm в высоту) на 20 минут один раз в день в течение трех дней. Во время этих сеансов привыкания в аренах размещают объекты, которые не будут использоваться при последующем тестировании.
3. На этапе привыкания следует фиксировать результаты ручного наблюдения за исследовательским поведением; запись и трекинг поведения не требуются.
4. На всех этапах задачи NPR арены тщательно очищают между животными с помощью 70% этанола, чтобы свести к минимуму влияние мешающих запаховых стимулов. Во всех испытаниях экспериментаторы помещают животных в центр арен в одном и том же положении, чтобы минимизировать вероятность того, что животные будут исследовать просто тот блок, рядом с которым они оказались.
5. Этап ознакомления и 5-минутный этап тестирования проводятся на четвертый день.
6. Для этапа ознакомления два идентичных пластиковых блока (8cm X 3cm X 10cm в высоту), тщательно очищенных 70% этанолом, размещают в определенных позициях внутри арен для тестирования. Каждое животное помещают в отдельную арену на 5 минут, предоставляя ему возможность свободного исследования.
7. Исследование двух одинаково знакомых пространственных позиций регистрируется с помощью автоматизированной системы трекинга. Для всех этапов исследованием считается нахождение носа животного в радиусе 4cm от блоков и его направление в сторону блоков.
8. После этапа ознакомления животных помещают в небольшую клетку для удержания на 5-минутный интервал задержки. В это время арены для тестирования очищают 70% этанолом и добавляют идентичные копии блоков: один в такую же пространственную позицию, как при ознакомлении, и один в новую пространственную позицию. Если крыса помнит пространственное расположение блоков с этапа ознакомления, она потратит больше времени на исследование блока, расположенного в новом месте.
9. После 5-минутного интервала задержки животных возвращают в арены для тестирования на 5-минутный этап теста. Они свободно исследуют пространство в течение 3 минут.
10. Через 24 часа после окончания этапа ознакомления животных снова возвращают в арены для 24-часового этапа тестирования. На этом этапе один блок остается в той же позиции, что и во время ознакомления и 5-минутного теста, а другой блок помещается в новую, незнакомую пространственную позицию. Опять же, если крыса помнит пространственное расположение блоков с этапа ознакомления накануне, она потратит больше времени на исследование блока в новой пространственной позиции.
11. Затем с помощью программы автоматизированного трекинга собираются данные о времени, затраченном на исследование блоков в различных пространственных позициях, которые могут быть статистически проанализированы для выявления различий между экспериментальными группами.
12. Для этапа ознакомления рассчитывается общее время, затраченное на исследование обеих пространственных позиций за все испытание. На этом этапе не должно быть разницы во времени исследования двух позиций, так как они одинаково знакомы/незнакомы животным (Рис. 2A). Кроме того, значительные различия в общем времени исследования между экспериментальными группами могут указывать на групповые вариации в мотивации к исследованию или уровнях тревожности, что следует учитывать при интерпретации результатов пространственной распознавательной памяти в двух тестовых фазах.
13. Для 5-минутного и 24-часового этапов тестирования рассчитывается коэффициент исследования следующим образом: (время исследования новой позиции - время исследования знакомой позиции) / общее время исследования (Рис. 2B). Таким образом учитывается индивидуальная вариабельность в мотивации исследовать объекты. Нормальные животные тратят значительно больше времени на исследование новой пространственной позиции, чем ожидалось бы случайно (отмечено пунктирной линией), после 5-минутного и 24-часового интервалов задержки (Рис. 2B).
14. Коэффициент исследования обычно рассчитывается для первых 60 секунд 5-минутного и 24-часового тестов⁴. Это связано с тем, что по мере проведения тестовых испытаний новая пространственная позиция становится более знакомой для животных. Таким образом, первая минута тестовых испытаний обеспечивает наиболее точную оценку пространственной распознавательной памяти.

2. Проведение теста «Приподнятый крестообразный лабиринт» (EPM)

1. Задание в приподнятом плюсообразном лабиринте (EPM) основано на процедурах Walf и Frye, 2007⁵.
2. Задание EPM используется для оценки тревожности у грызунов. Аппарат EPM представляет собой 4-плечий лабиринт (45" x 4"), приподнятый на 45" от уровня пола, где плечи расположены в форме плюса. Два плеча закрыты, а два — открыты. Показанный аппарат произведен компанией Med Associates Inc.
3. Поведение во время этого задания отражает конфликт между естественной мотивацией крысы исследовать новую среду (время, проведенное в открытых плечах) и предпочтением оставаться в защищенных зонах (закрытые плечи).
4. Экспериментальное помещение ярко освещено прожекторами, направленными на лабиринт, чтобы обеспечить достаточную мотивацию предпочитать закрытые, более тускло освещенные плечи.
5. Лабиринт тщательно очищается перед тестированием первого животного, а также между каждым испытанием.
6. Животное помещают в аппарат, удерживая его за передние конечности, и помещают в центральную часть лабиринта мордой к открытому плечу, которое находится дальше всего от экспериментатора. Каждое испытание длится 5 минут.
7. Путь животного отслеживается с помощью автоматизированного программного обеспечения для трекинга, чтобы можно было рассчитать количество заходов и время, проведенное в открытых и закрытых плечах. Могут отслеживаться дополнительные формы поведения, такие как вставание на задние лапы, груминг и наклоны головы за край аппарата. Заход засчитывается, когда центральная точка животного пересекает границу плеча.
8. Если крыса падает с лабиринта, ее быстро возвращают на открытое плечо, с которого она упала, и это событие фиксируется в журнале наблюдений. Если крыса замирает на длительный период времени, фиксируется такое поведение вместе с возможными причинами (например, внезапный громкий шум за пределами тестовой комнаты), и тестирование продолжается, чтобы все экспериментальные животные имели одинаковое время воздействия.
9. Время, проведенное в открытых плечах по сравнению с закрытыми, используется для расчета соотношения: время в открытых плечах / общее время в плечах. Аналогично рассчитывается соотношение заходов в открытые плечи к общему количеству заходов в плечи. С помощью автоматизированного ПО для трекинга также можно измерить общую пройденную дистанцию и скорость, чтобы оценить любые различия в моторных функциях между экспериментальными группами.
10. Снижение тревожности связано с увеличением доли времени, проведенного в открытых плечах, в то время как повышенная тревожность и страх связаны с большим временем пребывания в закрытых плечах. Нормальные животные проводят в открытых плечах значительно меньше времени, чем ожидалось бы при случайном выборе (обозначено пунктирной линией, Рис. 3). Более тревожные животные будут проводить пропорционально меньше времени в открытых плечах, в то время как менее тревожные животные будут проводить в них больше времени (например, после многократного пребывания в лабиринте или после применения анксиолитических препаратов).

3. Проведение задачи контекстуального и сигнального обусловливания страха (FC)

1. Описания задач контекстуального и сигнального обусловливания страха (FC) основаны на процедурах Schafe et al., 1999, Winocur et al., 2006 и MacLeod et al., 2007^6-8.
2. Задача обусловливания страха (FC) представляет собой поведенческую парадигму, в которой животные учатся бояться ранее нейтрального стимула (контекста, света или звукового сигнала; условного стимула) путем его сочетания с вредоносным стимулом (обычно слабым ударом тока в лапы; безусловным стимулом). Обучение происходит быстро, эффективно и является долгосрочным, поэтому задача FC часто используется для изучения нейробиологических механизмов обучения и памяти у грызунов.
3. Установка для FC представляет собой закрытую камеру размером 30см X 30см X 40см (Phenotyper, модель 3000, Noldus Information Technology). Пол камеры состоит из сетки из нержавеющей стали, которая используется для подачи электрического разряда. Phenotyper оснащен динамиком, который по запросу излучает сигнал частотой 2300Hz и интенсивностью 90dB, выступающий в роли условного стимула.
4. Разряд подается через генератор тока (Med Associates Inc.). Разряд вызывает кратковременный дискомфорт, который не приводит к длительной боли или повреждению тканей. Для тренировочных и тестовых сессий подача стимулов в виде разряда и звукового сигнала синхронизируется и контролируется автоматически с помощью модуля управления оборудованием и сессиями Ethovision XT (версия 7.0; Noldus Information Technology).
5. В первый день проводится обучение FC. Камера Phenotyper тщательно очищается 70% этанолом, и в нее помещается одно животное. Тренировочная сессия состоит из трех фаз: (1) базовой фазы, когда разряд или звук не подаются, (2) фазы обучения, когда предъявляются сочетания «звук-разряд», и (3) посттренировочной фазы, когда разряд или звук не подаются. Каждая фаза длится примерно 5 минут, таким образом, общее время тренировки составляет 15 минут на одно животное.
6. В фазе обучения звуковой сигнал подается в течение 30 секунд, и одновременно с окончанием сигнала на сетку подается разряд силой 1mA продолжительностью 1 секунда. Такое сочетание «звук-разряд» повторяется в общей сложности 5 раз с переменным интервалом от 10 до 60 секунд между каждым сочетанием.
7. В фазе обучения процент времени, в течение которого каждое животное остается неподвижным (ступор или freezing), измеряется за последние 60 секунд начальной базовой фазы (для установления уровня спонтанного ступора перед сочетанием «звук-разряд») и за последние 60 секунд посттренировочной фазы (для установления поведения ступора в ответ на сочетание «звук-разряд»). Здоровые животные демонстрируют очень низкий уровень ступора в базовой фазе и очень высокий (~95%) уровень ступора в посттренировочной фазе (Рис. 4).
8. Через 24 часа животное возвращают в тот же контекст и наблюдают в течение 5-минутного контекстуального теста FC. На этой фазе разряд или звук не подаются, и рассчитывается процент времени ступора за всю сессию. Обратите внимание на важность сохранения постоянства контекста от обучения до контекстуального теста. Фактически, необходимо, чтобы с животными в оба дня работал один и тот же экспериментатор. Здоровые животные проводят примерно 70% времени контекстуального теста в состоянии ступора (Рис. 4).
9. Сигнальный тест FC проводится через один час. Контекст камеры изменяется путем удаления сетчатого пола, добавления панелей к внешней стороне камеры и очистки пола ароматизированным бытовым чистящим средством. Поведение ступора животного наблюдается в течение первой минуты; уровень ступора очень низок, если контекст был изменен достаточно существенно (Рис. 4). Затем в течение 3 минут воспроизводится звук, за чем следует финальная минута тишины, после чего рассчитывается процент времени ступора. Здоровые животные демонстрируют высокий уровень ступора в это время (Рис. 4).
10. В общей сложности собираются 5 отдельных показателей поведения ступора: (1) базовый; (2) посттренировочный; (3) контекстуальный тест; (4) тест перед сигналом; (5) тест во время и после сигнала.
11. Отсутствие ступора в базовой фазе подтверждает нормальный уровень тревожности, в то время как значительный ступор в посттренировочной фазе указывает на сохранность сенсомоторных функций. Ступор при контекстуальном тесте подтверждает наличие 24-часовой памяти о контексте обучения, что зависит от сохранности функций гиппокампа и миндалевидного тела⁹. Отсутствие ступора в тесте перед сигналом свидетельствует о достаточном изменении первоначального контекста обучения. Ступор во время и после сигнала подтверждает наличие 24-часовой памяти на звуковой стимул, что зависит от сохранности функций миндалевидного тела⁹.

4. Проведение теста «Водный лабиринт Морриса» (MWM)

1. Процедуры выполнения задания в водном лабиринте Морриса основаны на предыдущих описаниях^10,11.
2. Задание в водном лабиринте Морриса (MWM) представляет собой тест на пространственное обучение грызунов, который требует использования отдаленных ориентиров для поиска скрытой платформы для спасения в большом бассейне с непрозрачной водой. Вокруг бассейна в определенных постоянных точках размещены крупные, отчетливые визуальные ориентиры. Животные учатся использовать эти ориентиры для навигации к скрытой платформе. За животными ведется наблюдение, и их извлекают из воды, если они не способны плыть.
3. Пространственное обучение оценивается в ходе повторных испытаний, а референтная память определяется путем оценки предпочтения области платформы при ее отсутствии. Испытания с обратным обучением (reversal trials) улучшают выявление пространственных нарушений и могут задействовать дополнительные области мозга, такие как лобная кора¹⁰.
4. Задание MWM проводится в течение 8 дней и состоит из 4 фаз: теста с видимой платформой (cued test), фазы освоения (acquisition phase), 24-часового зондового теста (probe test) и теста на обратное обучение.
5. Бассейн представляет собой изготовленный на заказ белый полиэтиленовый резервуар диаметром 200 cm и высотой 60 cm. Он заполнен водой примерно на 30 cm и сделан непрозрачным с помощью белой нетоксичной краски. Температура воды поддерживается в диапазоне от 20 до 22°C (68 и 72°F). Платформа для спасения представляет собой изготовленную на заказ прозрачную пластиковую подставку с круглой верхней частью диаметром 10 cm. Она находится примерно на 1.5 cm ниже поверхности воды.
6. Тест с видимой платформой состоит из 4 испытаний, проводимых в 1-й день. В этих испытаниях посередине платформы устанавливается заметный черно-белый флажок, чтобы место спасения было очевидным для животных. Чтобы минимизировать использование пространственной информации на этой фазе, ориентиры на стенах удаляются, а положение платформы и точки старта меняются от испытания к испытанию. Эта фаза помогает исключить любые сенсомоторные различия между экспериментальными группами до начала фазы освоения.
7. На всех фазах задания MWM животных держат за передние конечности и осторожно помещают в воду в назначенную точку старта, лицом к стенке бассейна. Животных тестируют когортами по 8 особей так, чтобы между каждыми из 4 ежедневных испытаний был интервал от 8 до 10 минут. В течение межиспытательных интервалов животные содержатся в прогреваемых клетках для предотвращения гипотермии.
8. В тесте с видимой платформой животному предоставляется максимум 30 секунд, чтобы забраться на платформу. Если максимальное время истекает до того, как животное спасется, экспериментатор вручную направляет его к платформе и помещает на нее. Животное остается на платформе для отдыха в течение 20 секунд, после чего его переносят в прогреваемую клетку.
9. В каждом испытании с видимой платформой животное стартует из определенной, заранее заданной точки по периметру бассейна, а сама платформа также перемещается в каждую из 4 различных позиций квадрантов.
10. Фаза освоения начинается на следующий день и состоит из 4 испытаний в день в течение 5 последовательных дней. На этой фазе скрытая платформа остается в одном и том же месте, и животные учатся находить ее, используя отдаленные ориентиры в комнате.
11. Снова для каждого из 4 испытаний животное помещается в бассейн в разную, заранее определенную точку старта. Каждый день две точки старта должны находиться слева, а две — справа от платформы в случайном порядке, чтобы избежать развития эгоцентрических пространственных стратегий решения задачи.
12. Максимальное время плавания для каждого испытания в фазе освоения составляет 60 секунд, после чего экспериментатор направляет животное и помещает его на платформу. После спасения животное остается на платформе на 20 секунд.
13. На 7-й день, через 24 ч после последнего тренировочного испытания, проводится 60-секундное зондовое испытание, при котором платформа удаляется. Эта фаза определяет предпочтение животного к тому квадранту, в котором ранее находилась платформа, и используется в качестве меры референтной пространственной памяти¹⁰. После зондового испытания платформа возвращается в тот же квадрант и проводятся 3 обычных испытания фазы освоения.
14. Для теста на обратное обучение в 8-й день платформа переносится в новое место, чтобы оценить способность к обратному обучению. Измерение времени, которое животные тратят на поиск платформы в ее прежнем месте по сравнению с новым местом, позволяет оценить персеверацию, или неспособность подавлять реакцию на прежнее местоположение после того, как платформа была перемещена¹⁰. Как и в фазах освоения и зондирования, проводятся 4 испытания по 60 секунд.
15. В тесте с видимой платформой латентный период нахождения платформы и скорость используются в качестве показателей зрительной и моторной функций соответственно. Различия между экспериментальными группами на этой фазе должны учитываться при интерпретации результатов освоения и памяти, так как могут существовать различия в сенсомоторных функциях между группами.
16. В фазе освоения средняя латентность нахождения платформы и/или длина пути используются в качестве показателей пространственного обучения. У здоровых животных латентный период спасения постепенно сокращается в течение пяти дней освоения так, что среднее время спасения на 5-й день составляет около 15–20 секунд (Рис. 5A).
17. В зондовой фазе среднее расстояние до платформы (Рис. 5B) и/или латентность первого достижения прежнего местоположения платформы (Рис. 5C) используются в качестве показателей референтной пространственной памяти.
18. В фазе обратного обучения процент времени, проведенного в старом квадранте по сравнению с новым квадрантом, содержащим платформу, используется в качестве меры персеверации. В ходе четырех испытаний предпочтение старого местоположения платформы должно снижаться по мере формирования предпочтения нового местоположения платформы (Рис. 5D).

5. Репрезентативные результаты:

Рисунок 1. Схематическое представление наших парадигм когнитивного тестирования.

Рисунок 2. Репрезентативные результаты контрольных животных при выполнении задачи на распознавание нового места. А) Общее время исследования двух пространственных позиций в фазе ознакомления должно быть примерно равным. Б) Коэффициент исследования (время исследования новой позиции / общее время исследования обеих позиций) демонстрирует явное предпочтение новой пространственной позиции после интервалов задержки в 5 минут и 24 часа. Пунктирная линия указывает на уровень случайного выбора.

Рисунок 3. Репрезентативные результаты контрольных животных в приподнятом крестообразном лабиринте. Здоровые животные проводят в открытых рукавах меньше времени, чем ожидалось бы при случайном выборе (показано пунктирной линией). Тревожные животные будут проводить в открытых рукавах пропорционально меньше времени по сравнению с контрольной группой, тогда как многократное помещение в лабиринт или воздействие анксиолитическими препаратами приведет к увеличению времени пребывания в открытых рукавах.

Рисунок 4. Репрезентативные результаты контрольных животных в задаче на кондиционирование страха. Низкий уровень замирания наблюдается при первоначальном помещении в камеру (исходный уровень) и при изменении контекста перед тестом с сигналом (пре-сигнальный тест). Напротив, здоровые животные проводят большую часть периода после обучения в состоянии замирания. Если животные помнят контекст, в котором проходило обучение, спустя 24 ч задержки, они проявляют замирание примерно в течение 70% 5-минутного контекстного испытания. Аналогично, если животные помнят звуковой сигнал, они демонстрируют высокий уровень замирания во время сигнального и пост-сигнального тестов.

Рисунок 5. Репрезентативные результаты контрольных животных в задании водного лабиринта Морриса. А) Латентный период поиска выхода сокращается по мере прогрессирующего обучения в фазе освоения. B) и C) Среднее расстояние до предыдущего местоположения платформы и время до первого пересечения этой точки в ходе 24-часового зондового теста используются в качестве показателей пространственной референсной памяти. D) Обучение реверсии оценивается путем изменения местоположения платформы в последний день тестирования. За 4 попытки здоровые животные постепенно перестают искать платформу в старом квадранте и запоминают ее новое местоположение.

Обсуждение

Существует острая необходимость в долгосрочных стратегиях, направленных на предотвращение развития когнитивной дисфункции, которая становится все более распространенной среди пациентов, перенесших рак^12,13. Терапия стволовыми клетками может стать средством облегчения ряда последствий в нормальных тканях ЦНС, так как она дает возможность заменить клетки, погибшие или поврежденные в результате цитотоксического лечения рака¹⁴. Чтобы ускорить реализацию этих усилий, мы провели серию экспериментов по подтверждению концепции, которые подтвердили способность чрепно имплантированных hNSCs функционально восстанавливать когнитивные функции в облученном участке ткани ЦНС³. Решающее значение для этой работы имела возможность надежно и воспроизводимо проводить серию тщательно контролируемых когнитивных тестов. Мы подробно описали эти критические процедуры, чтобы ускорить трансляционный потенциал терапии стволовыми клетками в клинике. Далее приведены дополнительные рекомендации, которые, вероятно, окажут существенное влияние на качество данных.

Когнитивное тестирование требует тщательного внимания к деталям, и соблюдение определенных стандартных практик может помочь минимизировать артефакты, затрудняющие интерпретацию результатов. Предпочтительным является использование специальных помещений для поведенческого тестирования, отделенных от комнат содержания животных и рабочих зон экспериментаторов. Также целесообразно использовать «белый шум», который блокирует внешние шумы в виварии, способные отвлекать животных от выполняемого задания. Чтобы минимизировать стресс у животных, предназначенных для когнитивного тестирования, важно, чтобы перед началом выполнения задач они привыкли к экспериментаторам, которые будут проводить поведенческие тесты. В целом, при тестировании самок и самцов рекомендуется сначала тестировать самок, так как они склонны проявлять большую тревожность во время тестирования, если в аренах остаются запаховые маркеры самцов. При проведении серии последовательных задач важно сначала подвергать животных наименее стрессовым тестам (например, EPM, NPR), а наиболее стрессовым — в последнюю очередь (например, FC, MWM).