Мощная модель для периоперационной и интенсивной терапии острого повреждения связанные почки представлена. Использование целых гипоперфузии тела индуцированных остановки сердца можно практически повторить гистологические и функциональные изменения клинической AKI.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Нормотермической остановку сердца и сердечно-легочной реанимации: мышиной модели ишемии-реперфузии
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Острое повреждение почек (АКИ) является общей, крайне опасная, усложнение критической болезни, которая имеет высокую смертность 1-4 и который чаще всего вызваны всего тела гипоперфузии. 5,6 Успешное воспроизводство всего тела гипоперфузии у грызунов моделей был сопряжен с трудностями. 7-9,9,10 Модели, которые работают фокальной ишемии неоднократно демонстрировали результаты, которые не переводят в клинических условиях, и больших животных, которые позволяют всему телу гипоперфузии не имеют доступа к полным набором инструментов генетических манипуляций возможно в мышь. 11,12 Однако, в последние годы мышиной модели остановку сердца и сердечно-легочной реанимации появился, которая может быть адаптирована к модели AKI. 13 Эта модель надежно воспроизводит физиологические, функциональные, анатомические и гистологические результаты наблюдаются в клинике AKI , быстро повторяемых и предлагает все значительные преимущества мышиной хирургической модели, включая доступ к генетическим манипулятивных техник, низкая относительная стоимость крупных животных, а также простоту в использовании. Наша группа разработала обширный опыт использования этой модели для оценки числа органов конкретных результатов в AKI. 14,15
Протокол
Все процедуры, описанные проводятся в соответствии с Национальными Институтами Здоровья рекомендации по уходу и использованию животных в научных исследованиях и всех животных протоколы были одобрены Oregon Health & Science University Институциональные уходу и использованию животных комитета.
1. Хирургическая подготовка
- Взвесьте мыши. Процедура, описанная осуществляется на C57BL / 6 мышей весом от 20 до 25 г. Анестезия индуцируется в индукции окна с помощью 3-4% изофлуран, а в дальнейшем поддерживать использование 1,5-2,5% изофлуран в воздухе / кислородной смеси.
- Смажьте глаза и положение животного на спине на грелку. Остановите 4 конечностей с помощью липкой ленты. Задние лапы может быть записано на пленку в нейтральное положение, однако, передние лапы должны быть закреплены как можно ближе к грудной стенке, как можно разрешить полный экскурсии грудной клетки при компрессии грудной клетки.
- Смажьте и место ректального датчика температуры. Температура контролируется с помощью грелки и лампы подключены к электронным контроллером температуры (Digi-Sense, Коул Пармер, Вернон Хиллс IL), который установлен для поддержания 37,0 ° C. Потому не исключено, что градиент температуры в пределах животного может развиться во время отсутствие потока государства, важно, чтобы температура измеряется и контролируется рядом органов, представляющих интерес.
- Интубация трахеи использованием 2,5 см 22 га тефлоновой катетер (Insyte-З, BD, Франклин штат Нью-Джерси) и сократить дистального конца угловой интродьюсер (Frova Introducer, Кук медицинский, Блумингтон IN). Другие методы интубации трахеи являются приемлемыми, однако, использование угловых интродьюсер позволяет правильно позиционирование шею в слегка растянутом положении, что позволяет оптимизировать хирургическое воздействие на размещение внутривенного катетера. Эндотрахеальной центром катетер закрепляется с петлей шва на резец и поддерживать с небольшим напряжением, чтобы обездвижить голову во время компрессии грудной клетки.
- Механически проветрить мышь с грызунами вентилятор установлен в 140 мкл, 150 вдохов / мин. Это не с поправкой на вес, как этот протокол всегда выполняется в 20-25 г животных. Не слишком углубляться анестезии. Не устанавливать вентилятор применять в конце выдоха давление, поскольку это ухудшает реанимации.
- Использование стерильных и операционный микроскоп, место предварительно промыть ПЭ-10 катетер в яремную вену. Любая сторона может быть использована, но использование стороны, более близкой к оператору снижает вероятность катетер смещение при компрессии грудной клетки или других манипуляций. 0,5% bupivicaine, 0,1 мл, infitrated на края раны для контроля послеоперационной боли.
- Безопасные ПЭ-10 катетера в кожу замыкание цианоакрилат хирургического клея.
- Место подкожных ЭКГ электроды и подключить к мониторингу устройства. Пристальное внимание к пути сигнала и максимизацию самого сигнала имеет решающее значение для успеха реанимации. Убедитесь, что все провода крепятся к рабочей поверхности, свести к минимуму сигнала переходов, и свести к минимуму изоляторов (как воздух в полых игл или многожильный провод) в пути сигнала. Твердые иглы подключены к nonstranded проводник могут быть куплены или сделаны в лаборатории. После подключения к сети, оптимизировать сигнал ЭКГ на экране монитора.
2. Остановка сердца
- Убедитесь, что мышь нормотермической, определяемой как ректальная температура 36,5 ° C - 37,5 ° C. Администрирование 40 мкл комнатной температуре 0,5 М хлористого калия внутривенно и наблюдать изоэлектрической трассировки на ЭКГ. Коррекция дозы для снижения веса не стоит в пределах 20-25 г. Начало арест таймер.
- Отключите вентилятора. Прекратите анестезии пара. Выключите грелку и любое другое оборудование, которое производит электронные шумы, которые могут помешать мониторинга ЭКГ. Место изоляционных одеяло на мышь.
- Запись температуры каждую минуту во время остановки сердца. При необходимости нагрева лампы могут быть использованы для достижения внутренней температуры до нормотермической диапазона. Во время остановки сердца, подготовить материалы и оборудование (например, адреналин шприц) для реанимации. Контрольный список может быть полезным для обеспечения бесперебойного реанимации, которая необходима для выживания.
- Через 7 минут, 30 секунд от сердечного приступа, подключите вентилятор и увеличить скорость до 180 вдохов / мин, сохраняя дыхательный объем на предварительном аресте обстановке.
- На 8 минут, начать непрямой массаж сердца при 300 BPM. Движение артефакт на ЭКГ могут быть использованы для скорости судить КПП. Непрямой массаж сердца должен быть доставлен с указательный палец, 5 мм выше мечевидного отростка и немного слева от средней линии. Грудь должна быть сжата 1/3-1/2 переднезаднем расстояния и полной отдачи должны быть разрешены между сжатий. Позиционирования пальцев и оптимальное давление сжатия абсолютно критическим. Неспособность добиться выживания в этой модели почти всегда из-за неоптимальных КПП.
- Настаивать 0,5 мл адреналина, разбавляют до 15 мкг / мл, в первые 30 секунд СЛР. Общая доза адреналина составляет 8-12 мкг. Тщательно соблюдайте ЭКГ для возвращения спонтанного кровообращения (РОСК). Узкий комплекс QRS комплексов видны между артефактов сжатия. РОСК обычно происходит между 90 секунд и 2 минуты после начала СЛР. Реанимация прекращается, если РОСК не происходит на 3 минуты. Частые преждевременное сокращение желудочков и изменения в ЭКГ оси наблюдаются в первые 2 минуты после РОСК, и почти всегда сводятся к устойчивым синусовая тахикардия на 2 минуты.
- Запись общего времени реанимации и адреналин дозы. Запись температуры каждую минуту в течение 10 минут после РОСК.
- ЭКГ приводит могут быть сняты при спонтанном дыхании начинается, обычно в течение 12-15 минут после РОСК.
- Экстубации трахеи, когда спонтанное частота дыхания составляет> 60/min.
- Место мыши в клетке на восстановление контролируемой температурой поверхности набора до 37 ° С в течение первых 2 часов postprocedure, обеспечивая легкий доступ к пище и воде. Клетки могут затем переехал в стандартной послеоперационной жилищных условий, когда мышь полностью оправилась от наркоза и является активным.
3. Кровотечения / перфузии-Фиксация и почек урожая
- 24 часов после CA / КПП, вызывают анестезию с изофлуран 3-4% и безопасной животное в положении лежа на спине на хирургическом поверхности в вытяжной шкаф, который подходит для использования с формалином ..
- Углубление анестезии, постепенно увеличивая концентрацию анестетика пара до 5% и обеспечить мыши глубоко под наркозом, о чем свидетельствует прекращение спонтанного дыхания.
- Выполните раскладушка торакотомия и обескровить мышь через апикальный пункция сердечной левого желудочка в соответствии со стандартными методами.
- Через ту же иглу, администрирования 0,9% физиологического раствора медленной инфузии. Для acclerate перфузии / кровопускания, ник в правом предсердии придаток ножницами. Выполните лапаротомии и наблюдать почки. Когда они побледнел, солевые может быть изменен на 4% формалина для фиксации. Почки затем заливали в парафин и окрашивали Фтор-нефрита B для количественного определения трубчатых эпителиальных некроза.
4. Представитель Результаты:
Когда CA индуцируется, среднего артериального давления (САД) и регионального почечного кровотока (RRBCF) падение почти до нуля и остается стабильным в течение реанимации начинается (рис. 1). 24 часов после CA / КПП, сыворотка показателей функции почек (азот мочевины крови, азота мочевины и креатинина) значительно повышенный по сравнению с ложнооперированных животных. AST / ALT также повышен, предлагая свидетельство глубокого всего тела ишемии (рис. 2). Нейтрофилов-желатиназа связанные lipocalin (нгап), чувствительным индикатором почечной ишемического повреждения в широких масштабах upregulated 24 часов после CA / CPR (рис. 3). Наконец, микрофотографии демонстрируют пятнистый, медуллярный некроз типичные ишемического повреждения почек с истончением эпителия и трубчатых просвета начинку на гематоксилином и эозином пятно (рис. 4, панели), а также обширную гибель клеток в мозговой трубчатого эпителия при окраске фтор-нефрита B ( На рисунке 4, панель б).
Рисунок 1. Остановка сердца вызывает мгновенной потере перфузионного давления, представлены здесь в виде среднего артериального давления (САД), измеряемый в бедренную артерию, в результате почти полного прекращения регионального почечного коркового кровотока (RRCBF) в течение периода от остановки сердца (заштрихованная области). Реанимация с непрямой массаж сердца и адреналин возвращается к нормальной MAP и RRCBF неуклонно повышается в период реанимации поста. Переизданный с разрешением от 14.
Рисунок 2. 24h postprocedure, азота мочевины крови (АМК), сывороточного креатинина, а также степень трубчатых клеточной смерти все значительно повышен у животных, подвергшихся CA / КПП по сравнению с животных, получавших процедуры обман. CA / CPR вызывает пан-организменном ишемического инсульта, здесь свидетельствует массивное повышение активности печеночных ферментов-функции аминокислот аланин трансферазы (АЛТ) и аспартатаминотрансферазы (АСТ) в ЦА / CPR мышей по сравнению с шам-обработанных животных.
Рисунок 3. Иммуноблоттинга выполняется с помощью поликлональных антител к нейтрофилов желатиназа связанных lipocalin (нгап), чувствительным индикатором почечной ишемического повреждения. Образцы мочи были получены непосредственно перед («до») и 24 часа после ("24 часа") CA / КПП в 4-х животных (помечены, б, в, г выше). Нгап является массово upregulated в мышьмочи после CA / КПП. Переизданный с разрешением от 14.
Рисунок 4.) Гематоксилин-эозином пятна короткий участок внутригрудной оси почечной ткани после 24h CA / КПП. Существует пятнистый, но ясно повреждение мозгового и corticomedullary трубочки с трубчатыми подключения. Стрелки указывают на поврежденные канальцы с опухшими, пикнотические ядер при corticomedullary перехода. Б) Flouro-нефрита B пятно того же региона в том же животное, 24 часа после CA / КПП. Фтор-нефрита пятна B отмершие клетки ярко-зеленый, показывая, пятнистый corticomedullary тубулярный некроз. Стрелки указывают на ярко окрашенных поврежденных канальцев в corticomedullary перехода. Эти выводы в основном аналогичны почечной биопсии от людей, которые разрабатывают АКИ, и в отличие от производства других моделей животных АКИ.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Нормотермической модель остановку сердца и сердечно-легочной реанимации в мышь имеет несколько направлений оценки в модель, которая имитирует патофизиологии и морфологии наиболее распространенных клинических причиной AKI всего тела гипоперфузии. Проверка гипотезы может быть оказана помощь за счет доступа к арсенал методов генной манипуляции и хорошо понимал и характеризуется анатомии и физиологии лабораторных мышей.
Как описано здесь, выживание в опытных руках составляет 80%. Хотя хирургичес...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Нет конфликта интересов объявлены.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Название реагента | Компания | Номер в каталоге | |
| Хлористый калий | Abbott Медицинская | 06653-5 | |
| Изофлюрана | Abbott Медицинская | 05260-05 (и другие) | |
| Адреналин HCl | Множественный | Множественный | |
| Digi-Sense регулятором температуры | Cole-Palmer | EW-89000-00 | |
| Angiocath IV Кэт | VWR | 381134 | |
| Frova угловой интродьюсер дыхательных путей | Повар | G27282 | |
| MicroVent Вентилятор для мышей | Гарвардский аппарата | 733591 |
Ссылки
- Chertow, G. M., Lazarus, J. M. Predictors of mortality and the provision of dialysis in patients with acute tubular necrosis. the auriculin anaritide acute renal failure study group. J Am Soc Nephrol. 9, 692-698 (1998).
- Lassnigg, A., Schmidlin, D. Minimal changes of serum creatinine predict prognosis in patients after cardiothoracic surgery: A prospective cohort study. J Am Soc Nephrol. 15, 1597-1605 (2004).
- Lassnigg, A., Donner, E. Lack of renoprotective effects of dopamine and furosemide during cardiac surgery. J Am Soc Nephrol. 11, 97-104 (2000).
- Metnitz, P. G., Krenn, C. G. Effect of acute renal failure requiring renal replacement therapy on outcome in critically ill patients. Crit Care Med. 30, 2051-2058 (2002).
- Uchino, S., Kellum, J. A. Acute renal failure in critically ill patients: A multinational, multicenter study. JAMA. 294, 813-818 (2005).
- Mehta, R. L., Pascual, M. T. Spectrum of acute renal failure in the intensive care unit: The PICARD experience. Kidney Int. 66, 1613-1621 (2004).
- Zager, R. A. Partial, aortic ligation: A hypoperfusion model of ischemic acute renal failure and a comparison with renal artery occlusion. J Lab Clin Med. 110, 396-405 (1987).
- Zager, R. A. Adenine, nucleotide changes in kidney, liver, and small intestine during different forms of ischemic injury. Circ Res. 68, 185-196 (1991).
- Oliver, J., MacDowell, M. The pathogenesis of acute renal failure associated with traumatic and toxic injury; renal ischemia, nephrotoxic damage and the ischemic episode. J Clin Invest. 30, 1307-1439 (1951).
- Phillips, R. A., Dole, V. P. Effects of acute hemorrhage and traumatic shock on renal function in dogs. Am J Physiol. 145, 314-336 (1945).
- Klocke, R., Tian, W. Surgical animal models of heart failure related to coronary heart disease. Cardiovasc Res. 74, 29-38 (2007).
- Traystman, R. J. Animal models of focal and global cerebral ischemia. ILAR J. 44, 85-95 (2003).
- Burne-Taney, M. J., Kofler, J. Acute renal failure after whole body ischemia is characterized by inflammation and T cell-mediated injury. Am J Physiol Renal Physiol. 285, 87-94 (2003).
- Hutchens, M. P., Nakano, T. Estrogen is renoprotective via a non-receptor dependent mechanism after cardiac arrest in vivo. Anesthesiology. 112, 395-405 (2010).
- Hutchens, M. P., Nakano, T. Soluble epoxide hydrolase gene deletion reduces survival after cardiac arrest and cardiopulmonary resuscitation. Resuscitation. 76, 89-94 (2007).
- Planta, I. von, Weil, M. H. Cardiopulmonary resuscitation in the rat. J Appl Physiol. 65, 2641-2647 (1988).
- Cobb, L. A., Fahrenbruch, C. E. Influence of cardiopulmonary resuscitation prior to defibrillation in patients with out-of-hospital ventricular fibrillation. JAMA. 281, 1182-1188 (1999).
- Aufderheide, T. P., Lurie, K. G. Death by hyperventilation: A common and life-threatening problem during cardiopulmonary resuscitation. Crit Care Med. 32, 345-351 (2004).
- Aufderheide, T. P., Sigurdsson, G. Hyperventilation-induced hypotension during cardiopulmonary resuscitation. Circulation. 109, 1960-1965 (2004).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
