$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Настройка и подготовка выборки
- Дополните сбалансированный солевой раствор Earle's (EBSS) бикарбонатом натрия (0,44 г на 100 мл EBSS) и глюкозой (0,884 г на 100 мл EBSS)9. Обработайте ЭБСС ДЭПК (0,1 мл на 100 мл ЭБСС) в течение не менее 12 часов при 37 °C в автоклавируемом флаконе или колбе с завинчивающейся крышкой.
- Поместите 5 стеклянных пипеток Пастера 3/4 дюйма в стеклянный стакан объемом 1000 мл и поместите кисти художника щетиной вверх в стеклянный градуированный цилиндр объемом 100 мл. Добавьте достаточное количество раствора DEPC (0,1 мл на 100 мл ddH2O), чтобы покрыть пипетки и щетки соответственно. Накройте стакан и градуированный цилиндр алюминиевой фольгой и выдерживайте не менее 12 часов при температуре 37 °C.
- После 12-часовой инкубации с DEPC нагрейте все материалы, обработанные DEPC, до температуры >100 °C в течение не менее 15 минут. Удалите EBSS и охладите до комнатной температуры перед хранением при 4 °C. Вылейте ddH2O подальше от стакана и градуированного цилиндра; Продолжайте инкубацию при температуре >100 °C до тех пор, пока материалы не высохнут. Вынуть, охладить до комнатной температуры и сохранить для последующего использования.
- В день эксперимента обработайте все рабочие поверхности препаратом РНКазеЗап.
- Поместите и поддерживайте EBSS на водяной бане, установленной при температуре 40 °C. Чтобы буферизировать и насыщать кислородом EBSS, инфильтрируйте 95%/5% O2/CO2, поместив газовую трубку в пипетку Пастера без РНКазы и вставив пипетку в EBSS. Закройте отверстие контейнера EBSS.
- Настройте тканевый слайсер Stoelting для использования при серийном срезе тканей головного мозга. Обработайте верхнюю и нижнюю поверхности слайсера для салфеток с помощью РНКазеЗап. Приложите прямоугольный кусок фильтровальной бумаги ватман #4 к поверхности измельчителя для салфеток из плексигласа. Прикрепите лезвие бритвы с обоюдным лезвием к рычагу измельчителя. Установите микрометр на ноль и отрегулируйте минимальную высоту рычага измельчителя так, чтобы лезвие бритвы могло резать фильтровальную бумагу, но не пластину из плексигласа.
- Соберите все дополнительные материалы, необходимые для микродиссекции, в том числе чашки для клеточных культур размером 60x15 мм, не содержащие РНКазы и тканевые пробоотборники Harris Uni-Core, наконечники для микропипеток объемом 200 мкл для крепления к газовым трубкам для оксигенации ЭБССС корональных срезов мозга во время пробивки микрообразцов, изогнутые ножницы, сухой лед и пробирки для забора тканей. Поместите трубки на сухой лед.
2. Удаление мозга и корональное сечение
- Поместите мышь в DecapiCone и обезглавьте с помощью гильотины для грызунов. Снимите головку с DecapiCone и положите на плоскую поверхность. С помощью скальпеля разрежьте кожу по средней линии черепа, начиная примерно на 3 мм каудально до ноздри. Боковой отшелушивание кожных лоскутов назад, чтобы обнажить черепную коробку и глазницы.
- С помощью изогнутых ножниц разрежьте оба зрительных нерва, разорвав их соединение с глазом. Вскрыть полость черепа, осторожно сломав затылочную и межтеменную кости и удалив дорсальную теменную и лобную кости. С помощью костного ронжера сломайте носовые и слезные кости, чтобы обнажить обонятельные луковицы. С помощью изогнутых ножниц отрежьте обонятельные луковицы от рострального мозга. Удалите весь мозг с неповрежденным задним мозгом. Поместите мозг в верхнюю часть чашки для клеточных культур Cellstar размером 60 x 15 мм, не содержащей РНКазы. Перенос на рабочую поверхность для отбора проб ткани.
- Используйте пипетку, не содержащую РНКазы, чтобы консервативно увлажнить фильтровальную бумагу на прикрепленном измельчителе тканей с помощью EBSS. Смочите ткани мозга с помощью EBSS.
- Перенесите мозг в измельчитель тканей и установите соответствующую ориентацию. Примечание: Мозг должен располагаться так, чтобы вентральная поверхность опиралась на фильтровальную бумагу. Срединная линия (межполушарная трещина) должна быть перпендикулярна лезвию измельчителя, а ростральный край мозга должен примыкать к лезвию.
- Используйте обработанную DEPC художественную кисть, чтобы удерживать мозг в неподвижном состоянии, мягко надавливая на тыльную поверхность мозга. Удерживая мозг в неподвижном положении, поднимите рычаг держателя лезвия вверх примерно на 4-5 см над поверхностью тыльной ткани и удерживайте его в таком положении. Снимите щетку с поверхности мозга и наберите 750 μм с помощью микрометра. Дайте рычагу опуститься, разрезая ткань и создав корональное сечение размером 750 мкм.
- Пока лезвие измельчителя остается неподвижным, используйте вращательные движения кистью художника, чтобы аккуратно смахнуть участок ткани от поверхности лезвия. Немедленно поместите срез ткани в насыщенный кислородом ЭБСС в чашке Петри. Второй исследователь может начать с шага 3.1.
- Повторяйте шаги 2.5 и 2.6 до тех пор, пока не будут получены последовательные срезы мозга по всей ростро-каудальной плоскости.
3. Микродиссекция области мозга
- Отрегулируйте освещение таким образом, чтобы освещение образца не было затруднено во время микродиссекции тканей. Отрегулируйте положение и расход 95%/5% смесиO2/CO2 для поддержания буферной, насыщенной кислородом среды для ткани во время микродиссекции.
- Определите корональный отдел мозга, который включает в себя интересующую область. Расположите участок мозга на дне чашки Петри с помощью кисти художника. Выберите пробоотборник для тканей с подходящим диаметром на основе таблицы 1 или других ссылок. Удерживая участок корональной ткани на месте кистью художника, опустите режущий кончик керна вниз по поверхности участка ткани.
- Оказывая давление, продавите кончик пробоотборника через тканевую часть и плотно опустите его на дно чашки Петри. Используйте вращающиеся круговые движения, чтобы убедиться, что интересующая область была диссоциирована от окружающих тканей. Осторожно поднимите пробоотборник для тканей в сторону от участка ткани и освободите микродырокол, позволяя ему плавать в EBSS.
- С помощью кисти художника немедленно поместите тканевый микродырокол в термостабильную при температуре -80 °C пробирку для хранения, хранящуюся на сухом льду. Ткань должна легко прилегать к боковой стороне трубки. Верните пробирку, содержащую микрообразцы, в сухой лед.
- Повторите шаги 3.2 - 3.4 для каждой интересующей вас области мозга.
4. Архивирование тканей
- После завершения микродиссекции используйте систему сканирования VisionMate для записи соответствующих штрих-кодов для каждой пробирки, содержащей образец TrakMates. После того как штатив для пробирок TrakMates на 96 слотов будет заполнен, быстро отсканируйте его и немедленно поместите образцы тканей в морозильную камеру при температуре -80 °C до извлечения РНК.
5. Общая экстракция РНК
- Подготовьте рабочую область, свободную от RNase, с помощью RNaseZap. Приготовьте достаточное количество смеси магнитных шариков и раствора для лизиса/связывания, как описано в протоколе выделения общей РНК MagMAX-9610.
- Извлеките образцы тканей из морозильной камеры при температуре -80 °C и поместите пробирки прямо на сухой лед.
- Добавьте 100 μL раствора для лизиса/связывания в пробирку TrakMates, содержащую образец. Прикрепите к смесителю гранул пестик объемом 0,5 мл объемом с тюбик без нуклеаз и гомогенизируйте ткань. С помощью наконечника пипетки без нуклеаз с низким уровнем удержания перенесите гомогенизированный образец в лунку на 96-луночном планшете для культуры тканей с круглым дном. Немедленно добавьте 60 мкл 100% изопропанола в образец с помощью наконечника пипетки без нуклеазы с низким уровнем удержания и перемешайте с помощью дозирования вверх и вниз 3-4 раза.
- Добавьте 20 мкл смеси гранул в образец с помощью наконечника пипетки без нуклеазы с низким удерживанием. Перемешайте, перебирая трубками вверх и вниз 3-4 раза.
- Повторите шаги 5.3-5.4 для всех образцов ткани.
- Следуйте инструкциям по протоколу выделения общей РНК MagMAX-96, начиная с III.A.2, чтобы завершить экстракцию полной РНК. заметка: Другие наборы для выделения полной РНК с помощью магнитных шариков коммерчески доступны; Однако в данном исследовании они не рассматривались. Пожалуйста, обратитесь к руководствам производителя для получения подробной информации о выделении полной РНК с использованием соответствующих продуктов.
- Измеряйте чистоту и концентрацию полученной общей РНК с помощью спектрофотометра NanoDrop 3300 или других малообъемных спектрофотометров/флуориметров.
6. Репрезентативные результаты:
См.
См.
См.
См.
См.
Кабель
мм
См.
мм
См.
См.
См.
См.
См.
См.
мм
| Область мозга/ядро | Диаметр пробоотборника для тканей (мм) | Общая РНК (нг/мкл) | Соотношение 260/280 |
| Лобная кора | 2.0 | 27.03 | 1.99 |
| Прилежащее ядро | 1.0 | 6.26 | 2.77 |
| Стриатум | 1.5 | 27,94 | 2.19 |
| Поясная кора | 1.5 | 29.05 | 2.07 |
| Гипоталамус - паравентрикулярное ядро / супрахиасматическое ядро (ПВН/СХЯ) | 2.0 | 40.34 | 2.03 |
| Таламуса | 2.0 | 34.40 | 2.00 |
| Гипоталамус - дорсомедиальное ядро / вентромедиальное ядро (DMH/VMH) | 2.0 | 44,83 | 2.05 |
| миндалина | 1.0 | 10.06 | 1,89 |
| Гиппокамп - Ca 2/3 | 1.5 | 7.31 | 2.32 |
| Гиппокамп - Ca1/зубчатая извилина | 1.5 | 5.20 | 2.24 |
| Периакведукальный серый | 1.0 | 48,21 | 2.02 |
| Дорсальное ядро рафе | 1.0 | 6.56 | 2.18 |
| Сетчатая формация | 2.0 | 35,35 | 2.27 |
Таблица 1. Подсчет микрорасчлененных областей мозга мыши с соответствующими оптимальными диаметрами пробоины тканей, репрезентативным выходом общей РНК и чистотой. 13 микрорасчлененных областей мозга, перечисленных в ростро-каудальном порядке, различаются по размеру и ориентации. Микропанч ПВН/СХН включает в себя переднемедиальное паравентрикулярное ядро, участки перивентрикулярного ядра, субпаравентрикулярную зону и другие парвоцеллюлярные нейроны. Микропунш таламуса включает в себя передние ядра таламуса, расположенные в той же корональной плоскости, что и область микропункции PVN/SCN. Микропунш DMH/VMH включает в себя добавочные магноцеллюлярные ядра и другие парвоцеллюлярные нейроны, расположенные между дорсомедиальным ядром и вентромедиальным ядром. Образец миндалевидного тела включает в себя как центральную, так и базолатеральную субобласти. Выход РНК и отношения 260/280 являются единичными значениями, полученными из соответствующих образцов микродиссекции для демонстрации показаний, полученных из каждой области мозга.