Профилирование экспрессии РНК в отдельных областях мозга мыши требует точной и воспроизводимой стратегии сбора тканей. В данной работе описывается протокол, сочетающий корональное секционирование мозга и микродиссекцию с использованием просекателя тканей. Выход и качество суммарной РНК, полученной из соответствующих образцов, подтверждают эффективность изложенного метода.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Номера для лазерной микроскопии Захват подход к микродиссекция дискретных областей мозга мыши для полной изоляции РНК и переработки нового поколения Секвенирование и профилирование экспрессии генов
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Такие технологические платформы и подходы, как секвенирование следующего поколения, микрочиповый анализ и qRT-PCR, открывают большие перспективы для расширения нашего понимания масштабов молекулярной регуляции. Более современные методы, такие как высокоразрешающее секвенирование РНК (RNA-Seq)1, предоставляют новую и обширную информацию о тканеспецифичной или зависящей от состояния экспрессии, включая относительные уровни транскриптов, альтернативный сплайсинг и микроРНК2-4. Возможности применения метода RNA-Seq для сравнительного профилирования всего транскриптома5 в отдельных тканях или между фенотипически различающимися группами особей открывают новые пути для выяснения молекулярных механизмов, участвующих как в нормальных, так и в патологических физиологических состояниях. Недавно было проведено профилирование всего транскриптома тканей головного мозга человека, в ходе которого были выявлены различия в экспрессии генов, связанные с прогрессированием заболевания6. Тем не менее, секвенирование следующего поколения еще не получило широкого внедрения в исследования млекопитающих.
Исследования экспрессии генов на моделях мышей с использованием лазерной захватной микроскопии (LCM) для иссечения образцов выявили отчетливые профили в различных ядрах мозга7,8. Хотя LCM позволяет осуществлять сбор образцов с точностью до отдельной клетки или отдельного отдела мозга, относительно низкий выход общей РНК при использовании этого метода может стать препятствием для проведения РНК-секвенирования (RNA-Seq) и других методов профилирования тканей мозга мыши, что может потребовать применения неоптимальных этапов амплификации образцов. В данной работе представлен протокол микродиссекции и экстракции общей РНК из отдельных отделов мозга мыши. Для изолирования 13 типов тканей из серийных корональных срезов мозга одной мыши толщиной 750-μm используются тканевые просекатели с фиксированным диаметром. Образцы, полученные методом микропанчинга, немедленно замораживают и архивируют. Общая РНК выделяется из образцов с помощью технологии изоляции общей РНК на магнитных частицах. Полученные образцы РНК обладают достаточным выходом и качеством для последующего профилирования экспрессии. Данная стратегия микродиссекции представляет собой жизнеспособную альтернативу существующим методам сбора образцов для получения общей РНК из отдельных отделов мозга, открывая возможности для новых открытий в области экспрессии генов.
Протокол
1. Организация и подготовка к отбору проб
- Добавьте в сбалансированный солевой раствор Эрла (EBSS) бикарбонат натрия (0,44 г на 100 мл EBSS) и глюкозу (0,884 г на 100 мл EBSS)9. Обработайте EBSS с помощью DEPC (0,1 мл на 100 мл EBSS) в течение не менее 12 часов при 37 °C в автоклавируемой бутылке или колбе с завинчивающейся крышкой.
- Поместите стеклянные пастеровские пипетки объемом 5 ¾" в стеклянный стакан на 1000 мл, а художественные кисти щетиной вверх — в стеклянный мерный цилиндр на 100 мл. Добавьте достаточное количество раствора DEPC (0,1 мл на 100 мл ddH2O), чтобы полностью покрыть пипетки и кисти соответственно. Закройте стакан и мерный цилиндр алюминиевой фольгой и инкубируйте не менее 12 часов при 37 °C.
- После 12-часовой инкубации с DEPC нагрейте все обработанные DEPC материалы до температуры >100 °C минимум на 15 минут. Слейте EBSS и охладите до комнатной температуры перед хранением при 4 °C. Слейте ddH2O из стакана и мерного цилиндра; продолжайте инкубацию при >100 °C до полного высыхания материалов. Извлеките материалы, охладите до комнатной температуры и храните до дальнейшего использования.
- В день проведения эксперимента обработайте все рабочие поверхности средством RNaseZap.
- Поместите EBSS в водяную баню, настроенную на 40 °C, и поддерживайте эту температуру. Для буферизации и оксигенации EBSS продуйте его смесью 95%/5% O2/CO2, поместив газовую трубку в свободную от РНказ пастеровскую пипетку и погрузив пипетку в EBSS. Закройте отверстие контейнера с EBSS.
- Подготовьте тканевый срезограф Stoelting для серийного секционирования тканей мозга. Обработайте верхнюю и нижнюю поверхности срезографа средством RNaseZap. Прикрепите прямоугольный фрагмент фильтровальной бумаги Whatman №4 к поверхности из оргстекла на тканевом срезографе. Установите двустороннее лезвие бритвы на рычаг срезографа. Установите микрометр на ноль и отрегулируйте минимальную высоту рычага таким образом, чтобы лезвие бритвы прорезало фильтровальную бумагу, но не затрагивало пластину из оргстекла.
- Подготовьте все дополнительные материалы, необходимые для микродиссекции, включая чашки для культивирования клеток 60x15 мм без РНказ, трепаны для тканей Harris Uni-Core, наконечники для микропипетки объемом 200 μL без РНказ для крепления к газовой трубке для оксигенации корональных срезов мозга во время выбивания микропроб, изогнутые ножницы, сухой лед и пробирки для сбора тканей. Поместите пробирки на сухой лед.
2. Извлечение мозга и изготовление корональных срезов
- Поместите мышь в DecapiCone и проведите декапитацию с помощью гильотины для грызунов. Извлеките голову из DecapiCone и положите ее на плоскую поверхность. С помощью скальпеля сделайте разрез кожи по срединной линии черепа, начиная примерно на 3 mm каудально от ноздри. Отогните кожные лоскуты латерально, чтобы обнажить череп и глазницы.
- С помощью изогнутых ножниц перережьте оба зрительных нерва, разорвав их связь с глазом. Вскройте полость черепа, осторожно разломав затылочные и межтеменные кости и удалив дорсальные теменные и лобные кости. С помощью костной кусачки разломайте носовые и слезные кости, чтобы обнажить обонятельные луковицы. Используя изогнутые ножницы, отсеките обонятельные луковицы от ростральной части мозга. Извлеките весь мозг, сохранив задний мозг неповрежденным. Поместите мозг в верхнюю часть чашки для культивирования клеток Cellstar размером 60 x 15 mm, не содержащей РНказы. Перенесите образец на рабочую поверхность для отбора тканей.
- С помощью пипетки, не содержащей РНказы, осторожно увлажните фильтровальную бумагу прикрепленного томического резака (tissue chopper) раствором EBSS. Увлажните ткани мозга раствором EBSS.
- Перенесите мозг на резак и установите правильную ориентацию. Примечание: мозг должен быть расположен вентральной поверхностью на фильтровальной бумаге. Срединная линия (межполушарная щель) должна быть перпендикулярна лезвию резака, а ростральный край мозга должен прилегать к лезвию.
- Используйте художественную кисть, обработанную DEPC, чтобы зафиксировать мозг, оказывая легкое давление на его дорсальную поверхность. Удерживая мозг неподвижно, поднимите рычаг держателя лезвия примерно на 4-5 cm над дорсальной поверхностью ткани и удерживайте его в этом положении. Уберите кисть с поверхности мозга и с помощью микрометра установите значение 750 μm. Отпустите рычаг, чтобы разрезать ткань и получить корональный срез толщиной 750 μm.
- Пока лезвие резака остается неподвижным, аккуратными перекатывающими движениями кисти осторожно сдвиньте срез ткани с поверхности лезвия. Немедленно поместите срез ткани в оксигенированный EBSS в чашку Петри. Второй исследователь может приступить к шагу 3.1.
- Повторяйте шаги 2.5 и 2.6 до тех пор, пока не будут получены серийные срезы мозга по всей рострокаудальной плоскости.
3. Микродиссекция областей мозга
- Отрегулируйте освещение так, чтобы подсветка образца не была перекрыта во время микродиссекции ткани. Отрегулируйте положение и поток смеси 95%/5% O2/CO2 для поддержания буферизированной, оксигенированной среды для ткани в процессе микродиссекции.
- Найдите корональный срез мозга, содержащий интересующую область. Используя художественную кисть, расположите срез мозга плотно на дне чашки Петри. Выберите просекатель ткани подходящего диаметра согласно Таблице 1 или другим источникам. Удерживая корональный срез ткани кистью, опустите режущий наконечник просекателя на поверхность среза ткани.
- Прикладывая давление, просуньте наконечник просекателя сквозь срез ткани до упора в дно чашки Петри. Используйте вращательное движение по кругу, чтобы убедиться, что интересующая область была отделена от окружающей ткани. Осторожно поднимите просекатель со среза ткани и высвободите микропанч, позволяя ему плавать в EBSS.
- С помощью художественной кисти немедленно перенесите микропанч ткани в пробирку для хранения, устойчивую к температуре -80 °C, которая находится на сухом льду. Ткань должна легко прилипнуть к стенке пробирки. Верните пробирку с микрообразцом на сухой лед.
- Повторите шаги 3.2 – 3.4 для каждой интересующей области мозга.
4. Архивация тканей
- По завершении микродиссекции используйте сканирующую систему VisionMate для регистрации соответствующих штрих-кодов каждой пробирки TrakMates, содержащей образец. После заполнения 96-луночного штатива для пробирок TrakMates быстро отсканируйте штатив и немедленно поместите образцы тканей в морозильник при -80 °C до начала экстракции RNA.
5. Экстракция всей РНК
- Подготовьте рабочее пространство, свободное от РНаз, используя RNaseZap. Приготовьте достаточное количество смеси магнитных частиц (Bead Mix) и раствора для лизиса/связывания (Lysis/Binding Solution) согласно протоколу выделения общей РНК MagMAX-9610.
- Извлеките образцы тканей из морозильной камеры при -80 °C и поместите пробирки непосредственно на сухой лед.
- Добавьте 100 μL раствора для лизиса/связывания в пробирку TrakMates с образцом. Установите безнуклеазный пестик для пробирок объемом 0,5 мл в гомогенизатор и гомогенизируйте ткань. С помощью наконечника для пипеток с низкой адсорбцией, свободного от нуклеаз, перенесите гомогенизированный образец в лунку круглодонного 96-луночного планшета для культивирования тканей. Немедленно добавьте в образец 60 μL 100% изопропанола, используя наконечник для пипеток с низкой адсорбцией, свободный от нуклеаз, и перемешайте, 3-4 раза прокачав жидкость через пипетку.
- Добавьте 20 μL смеси Bead Mix в образец, используя наконечник для пипеток с низкой адсорбцией, свободный от нуклеаз. Перемешайте, 3-4 раза прокачав жидкость через пипетку.
- Повторите шаги 5.3-5.4 для всех образцов тканей.
- Следуйте инструкциям протокола выделения общей РНК MagMAX-96, начиная с этапа III.A.2, для завершения экстракции общей РНК. ПРИМЕЧАНИЕ: В продаже доступны и другие наборы для выделения общей РНК на основе магнитных частиц; однако в данном исследовании они не рассматривались. Информацию о деталях выделения общей РНК с использованием соответствующих продуктов см. в руководствах производителя наборов.
- Измерьте чистоту и концентрацию полученной общей РНК с помощью спектрофотометра NanoDrop 3300 или других технологий спектрофотометрии/флуориметрии для малых объемов.
6. Репрезентативные результаты:
| Область мозга/ядро | Диаметр трепана для тканей (mm) | Общая РНК (ng/μL) | Отношение 260/280 |
| Фронтальная кора | 2.0 | 27.03 | 1.99 |
| Прилежащее ядро | 1.0 | 6.26 | 2.77 |
| Стриатум | 1.5 | 27.94 | 2.19 |
| Поясная кора | 1.5 | 29.05 | 2.07 |
| Гипоталамус — паравентрикулярное ядро / супрахиазматическое ядро (PVN/SCN) | 2.0 | 40.34 | 2.03 |
| Таламус | 2.0 | 34.40 | 2.00 |
| Гипоталамус — дорсомедиальное ядро / вентромедиальное ядро (DMH/VMH) | 2.0 | 44.83 | 2.05 |
| Миндалевидное тело | 1.0 | 10.06 | 1.89 |
| Гиппокамп — Ca 2/3 | 1.5 | 7.31 | 2.32 |
| Гиппокамп — Ca1/зубчатая извилина | 1.5 | 5.20 | 2.24 |
| Периакведуктальное серое вещество | 1.0 | 48.21 | 2.02 |
| Дорсальное ядро шва | 1.0 | 6.56 | 2.18 |
| Ретикулярная формация | 2.0 | 35.35 | 2.27 |
Таблица 1. Перечень микродиссекированных областей мозга мыши с соответствующими оптимальными диаметрами пробойника для ткани, репрезентативным выходом общей РНК и степенью чистоты. 13 микродиссекированных областей мозга, перечисленных в рострокаудальном порядке, различаются по размеру и ориентации. Микропанч PVN/SCN включает переднеемедиальное паравентрикулярное ядро, части перивентрикулярного ядра, субпаравентрикулярную зону и другие парвоцеллюлярные нейроны. Микропанч таламуса включает передние ядра таламуса, расположенные в той же корональной плоскости, что и область микропанча PVN/SCN. Микропанч DMH/VMH включает дополнительные магноцеллюлярные ядра и другие парвоцеллюлярные нейроны, расположенные между дорсомедиальным и вентромедиальным ядрами. Образец миндалевидного тела включает как центральную, так и базалатеральную подзоны. Выход РНК и соотношения 260/280 представляют собой единичные значения, полученные из соответствующих образцов микродиссекции для демонстрации показателей каждой области мозга.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
В данном протоколе есть несколько критических этапов, требующих тщательного внимания и учета. Для извлечения каждой соответствующей области интереса необходимо определить подходящий диаметр трепана для забора тканей. Хотя диаметры трепанов, представленные в Таблице 1, подходят для сбора указанных областей мозга, каждому исследователю следует самостоятельно подобрать размер трепана для оптимального забора интересующих его тканей. Во-вторых, толщина коронального среза, указанная в данном методе (750 μm), была экспериментал...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Конфликт интересов не заявлен.
Благодарности
Данная работа была профинансирована Агентством передовых исследовательских проектов Министерства обороны США (DARPA) и Исследовательским управлением Армии США (ARO), номер гранта W911NF-10-1-006.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Водяная баня Isotemp 102 | Fisher Scientific | 15-460-3Q | |
| RNase Zap | Ambion | AM9782 | |
| Лабораторный ротатор (орбитальный шейкер) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 2314 –- 1CEQ | |
| Смеситель для гранул | VWR international | 47747-370 | |
| Пестик объемом 0,5 мл, свободный от РНказ | VWR international | KT749521-0590 | Без нуклеаз |
| Диэтилпирокарбонат (DEPC) | Sigma-Aldrich | D5758-50ML | |
| Двусторонние лезвия бритвы | Stoelting Co. | 51427 | |
| Ст.–аппарат для получения срезов тканей с ручным микрометром | Stoelting Co. | 51425 | |
| Круглая художественная кисть размера 2/0’щетка | Кисть Princeton Art Brush | 4350R | |
| Биопсийный трепан Harris Uni-Core (0,75 мм) | Ted Pella, Inc. | 15072 | |
| Трепан для забора образцов тканей Harris Uni-Core (1,0 мм) | Ted Pella, Inc. | 15099 | |
| Тканевый трепан Harris Uni-Core (1,5 мм) | Ted Pella, Inc. | 15075 | |
| Тканевый трепан Harris Uni-Core (2,0 мм) | Ted Pella, Inc. | 15076 | |
| Гильотина | Braintree Scientific, Inc. | RG-100 | |
| Декапиконусы | Braintree Scientific, Inc. | MDC-200 | |
| HyClone Earle’сбалансированный солевой раствор Эрнста (EBSS) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH30029.02 | |
| пипетки на 25 мл | Corning | 4489 | без нуклеаз |
| наконечники для дозатора epT.I.P.S. LoRetention с двойным фильтром, 20 мкл — 300 μL | Eppendorf | 0030 077.636 | |
| Пробирки TrakMates с завинчивающимися крышками | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 3741 | |
| беспроводной 2D-сканер штрихкодов VisionMate | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 3122MTX | |
| 2D-сканер штрихкодов для одного штатива VisionMate SR | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 3115 | |
| 1-200 μуниверсальные наконечники для дозаторов L | Corning | 4864 | Без нуклеаз |
| Чашки для культивирования клеток Cellstar | Greiner Bio-One | 628160 | Безнуклеазный |
| 96-луночный полистирольный планшет для культивирования тканей Cellstar от Greiner Bio-One, с U-образным дном | USA Scientific, Inc. | 5665-0180 | Не содержащий нуклеаз |
| #4 Фильтровальная бумага | Whatman, GE Healthcare | 1004 150 | |
| Силиконовый грушеобразный насадочный дозатор для безопасного пипетирования | Fisher Scientific | 13-681-102A | |
| Спектрофотометр NanoDrop 3300 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ND-3300 |
Ссылки
- Pickrell, J. K. Understanding mechanisms underlying human gene expression variation with RNA sequencing. Nature. 464, 768-772 (2010).
- Costa, V., Angelini, C., De Feis, I., Ciccodicola, A. Uncovering the complexity of transcriptomes with RNA-Seq. J. Biomed. Biotechnol. 853916, (2010).
- Nagalakshmi, U., Waern, K., Snyder, M. RNA-Seq: a method for comprehensive transcriptome analysis. Curr. Protoc. Mol. Biol. Chapter 4, 11-13 (2010).
- Anglicheau, D., Muthukumar, T., Suthanthiran, M. MicroRNAs: small RNAs with big effects. Transplantation. 90, 105-112 (2010).
- Forrest, A. R., Carninci, P. Whole genome transcriptome analysis. RNA. Biol. 6, 107-112 (2009).
- Twine, N. A., Janitz, K., Wilkins, M. R., Janitz, M. Whole transcriptome sequencing reveals gene expression and splicing differences in brain regions affected by Alzheimer's disease. PLoS One. 6, e16266-e16266 (2011).
- Paulsen, S. J. Gene expression profiling of individual hypothalamic nuclei from single animals using laser capture microdissection and microarrays. J. Neurosci. Methods. 177, 87-93 (2009).
- Winrow, C. J. Refined anatomical isolation of functional sleep circuits exhibits distinctive regional and circadian gene transcriptional profiles. Brain. Res. 1271, 1-17 (2009).
- Atkins, N. Circadian integration of glutamatergic signals by little SAAS in novel suprachiasmatic circuits. PLoS One. 5, e12612-e12612 (2010).
- Technologies, L. MagMAX-96 Total RNA Isolation Kit Instruction Manual. , Forthcoming.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
