CD4 + T-лимфоцитов Захват Использование одноразовых микрофлюидный чип на ВИЧ

Протокол

1. Подготовка микрожидкостных каналов с анти-CD4 ⁺ biotinlayted поверхности.
2. Inject 10 мл образца крови в 5 мл / мин в микрожидкостных канал с шприцевой насос.
3. Промойте крови на 20 мл / мин в течение 20 мин с PBS.
4. Inject разбавленный FACS лизирующего раствора (разбавляют до 10% от исходного раствора с PBS) в 5ul/min течение 15 мин.
5. Инкубировать 15 мин.
6. Inject первичной CD3 ⁺ раствор антител (разбавляют до 10% от исходного раствора с PBS) в 5 мл / мин в течение 20 мин.
7. Инкубируйте в течение 2 часов.
8. Промойте канал PBS в 5 мл / мин в течение 15 мин.
9. Inject 20% AF488 CD4 ⁺ антитела, 0,2% DAPI маточного раствора, а 10% вторичных антител CD3 ⁺ в 5 мл / мин в течение 20 мин, в то же время.
10. Инкубируйте в течение 20 мин.
11. Промойте канал PBS в 5 мл / мин в течение 15 мин.
12. Граф клетки под флуоресцентным микроскопом:
    1. Белый (оптический) - Черно-белый: клетки и пыли
    2. УФ (DAPI) - Синий: только клеток
    3. Синий (CD4 ⁺⁾ - Зеленый: Т-лимфоцитов и моноцитов
    4. Зеленый (CD3 ⁺⁾ - Красный: Т-лимфоцитов только

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Микроканал из PDMS				Изготовлен с использованием формы из SU-8
Кровь				Донорская кровь здорового человека. Больница общего профиля Массачусетса (Mass General Hospital), 10 X высокая плотность WBC или Больница Бригама и Женщин (Brigham and Women’s Hospital).
PBS	Буфер	Invitrogen	14190	1x фосфатно-солевой буфер Дульбекко (Dulbecco’s Phosphated Buffered Saline).
Лизирующий раствор для FACS		BD Biosciences	349202	Разведен до 10% из стокового раствора с помощью PBS.
Биотинилированные антитела к CD4+		Beckman Coulter Inc.	IM0704	Поверхность подготовлена биотинилированными антителами к CD4+, разведенными до 10% из стокового раствора с помощью PBS/BSA после смешивания 0.2mg стока и 1ml деионизированной воды.
козьи антитела к hCD3delta	pAB	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	sc-1128	Разведены до 10% из стокового раствора с помощью PBS
кроличьи антитела к козьим IgG PE		Santa Cruz Biotechnology, Inc.	sc-3755	Вторичные антитела для антител к anti-CD3, разведены до 10% из стокового раствора с помощью PBS
антитела к человеческому CD4+		BD Biosciences	557695	Меченые Alexa Fluor 488, разведены до 20% из стокового раствора с помощью PBS.
DAPI		Invitrogen	D1306	Раствор дигидрохлорида 4’,6-диамидино-2-фенилиндола, разведен до 0.2% из стокового раствора с помощью PBS.