NIH3T3 клетки подготовки:
А. Клетки для выброса
- Trypsinize клетки, затем разбавить 1:1 с ячейки СМИ, и переход от T75 колбу на 15 мл трубки Сокол
- Спином вниз клеток в гранулах центрифугированием, супернатант аспирацию и промыть клетки с DPBS
- Спином вниз клеток в гранулах снова, и аспирата супернатант
- Ресуспендируют клеток в СМИ
- Определить плотность клеток с гемоцитометра (~ 200 X 10 4 клеток / мл в колбе T75)
- Решение Центрифуга клетки, аспирацию супернатант, и ресуспендируют в соответствующую сумму средств массовой информации для различной концентрации клетка
Б. сотовый выброса
- Vortex клетки, прежде чем использовать для выброса
- Передача 200 мкл клеточного раствора в шприце
- Установить соответствующий режим генератора импульсов
- Для извлечения одной капли и несколько капель (очередей), установить генератор импульсов, чтобы "Е. БУР" режиме
- Для непрерывного выброса капли, установить генератор импульсов, чтобы "НОРМА" режиме
- Изменение параметров сигнала
- Установить высокий уровень и низкий уровень выходного напряжения: HIL до 5 В и LOL 0 В и убедитесь, что "LIM" светодиод
- Установить сигнал как прямоугольный импульс
- Изменение количества времени электромагнитный клапан открыт для выброса капли, изменив значение для "WID" или изменение рабочего цикла («Долг»)
- Изменение частоты выброса, изменив значение для "ЗА"
- Изменение количество капель, выброшенных в порыве, изменив значение для "БУР"
- Извлечь решение ячейки на подготовленное основание для работы с изображениями с микроскопом
С. Окрашивание
- Макияж раствор красителя с 0,5 мкл кальцеин-AM и 2 мкл гомодимера этидия на мл DPBS
- Погрузите подготовленное основание в раствор красителя
- Разрешить образец для инкубации в течение 10 минут при 37 ° С до визуализации
Эксперимент Проверка
- На Nikon Eclipse TE-2000 U Флуоресцентный микроскоп
- Пятно передовое программное обеспечение (Diagnostics, Inc)
- Live / Мертвые Пробирной
