Стереотаксическая микроинъекция вирусного вектора для генной манипуляции у щенка мышиного стриатума

Аннотация

Источник: Chen, S., et al., Stereotaxic Surgery for Genetic Manipulation in Striatal Cells of Neonatal Mouse Brains. J. Vis. Exp. (2018)

В этом видео демонстрируется стереотаксическая инъекция вирусного вектора, кодирующего Cre-рекомбиназу и зеленый флуоресцентный белок или GFP, в стриатум генетически модифицированного мышиного щенка для осуществления манипуляций с генами путем вырезания STOP-кассеты с локсP-флангом, активации красного флуоресцентного белка или RFP в качестве репортера.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными моделями, были рассмотрены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным советом JoVE.

1. Микроинъекция

1. Подготовьте стерильную хирургию, тщательно протерев стереотаксический инструмент 70% этанолом. Погрузите хирургический инструмент в 70% этанол, чтобы стерилизовать его.
2. Потрите голову щенка 70% этанолом. Найдите ориентир лямбды на черепе и отметьте лямбду маркером. Направьте кончик иглы на лямбду и установите передне-заднюю (AP) и медиально-латеральную (ML) координаты равными нулю.
3. Переместите инъекционный рукав к целевому участку в соответствии с координатами X и Y целевого участка. Для стриатума постнатального дня (P) 2 щенков координаты: AP, +2,4 мм перед лямбдой; ML, ±1,0 мм латерально от средней линии; дорсально-вентральный (DV), −1,7 мм от черепа. Отметьте ручкой положение быстрого зеленого красителя в пробирке PE10
.
4. Медленно опустите инъекционную иглу 30G, чтобы она проникла через кожу и череп, а затем поднимите кончик иглы вверх, пока он не остановится на поверхности черепа. Установите координату DV равной нулю.
5. Медленно опустите иглу для инъекции 30G, пока она не достигнет координаты DV целевого места. Подождите 1 минуту, чтобы паренхима восстановила свою нормальную форму. Затем запустите программу микровпрыска (100 нл/мин).
6. Убедитесь, что метка быстрого зеленого красителя движется в полиэтиленовой трубке, чтобы обеспечить попадание вирусной жидкости в мозг.
7. Подождите 1 минуту после окончания микроинъекции, а затем медленно и постепенно поднимите иглу вверх на 1/2 высоты глубины DV в течение 30 с. Через 30 с медленно извлеките иглу из головы щенка.

2. Послеоперационное восстановление щенка

1. Прогрейте щенка в течение 20 минут в инкубаторе при температуре 33 °C. Проверяйте восстановление щенка после гипотермической анестезии каждые 5 минут до тех пор, пока щенок не придет в сознание, достаточное для поддержания лежачего положения на грудине.
2. Верните щенка к матери после того, как щенок полностью выздоровеет.

Материалы