Все процедуры, связанные с животными моделями, были рассмотрены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным советом JoVE.
1. Сборка пипетки для записи и впрыска
- Потяните стеклянный капилляр длиной около 7 см (внешний диаметр 1 мм) с помощью съемника для пипетки.
- Разломайте кончик капилляра и проверьте отверстие под световым микроскопом. Убедитесь, что внутренний диаметр составляет от 30 мкм до 40 мкм.
- Вставьте серебряную проволоку длиной 7 см в стеклянный капилляр с примерно 1 см, выступающей из неконического конца стеклянной пипетки.
- Согните лишнюю нить перпендикулярно стеклянному капилляру.
- Нанесите каплю гибкого пластичного клея на стержень иглы для подкожных инъекций 30 G.
- Введите иглу для подкожных инъекций 30 G в стеклянную пипетку в соответствии со схемами, представленными на рисунке 1.
- Добавьте второй слой клея, чтобы обеспечить надлежащую герметизацию от места соединения между стеклянной пипеткой и иглой для подкожных инъекций.
- Дайте пипетке высохнуть кончиком вверх примерно на 12 часов, чтобы обеспечить надлежащее отверждение клея. Готовый результат показан на рисунке 2.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура проводится в ходе острых экспериментов и стерилизация наконечника пипетки не требуется.
2. Подготовка животного
- животного Поместите крысу в бокс для анестезии.
- Вызвать анестезию с помощью 4% изофлурана в течение 5-10 минут.
- Поместите животное на стереотаксический стол с грелкой и ректальным зондом для поддержания температуры тела 37 °C. Используйте носовой конус для поддержания анестезии с 2% изофлураном. Закрепите голову крысы с помощью ушных упоров и держателя для зубов.
- Нанесите офтальмологическую мазь или глазные капли, которые содержат 1% капли атропина, чтобы помочь расширению зрачка. Чтобы предотвратить сухость, наносите смазывающие капли примерно каждые 30 минут.
- Побрейте голову и очистите ее 10% повидон-йодом.
- Для местной анестезии введите 0,5 мл 2% лидокаина под волосистую часть головы в 2-3 местах, приподняв кожу вверх и вставив кончик иглы.
- Подтвердите достаточный уровень анестезии, выполнив щипление пальца ноги и наблюдая за отсутствием движения. Кроме того, следите за частотой сердечных сокращений, чтобы убедиться, что она находится в пределах нормы (от 300 до 400 уд/мин).
- Надрежьте кожу головы по прямой линии вдоль срединной линии лезвием скальпеля #10, чтобы обнажить как корональные, так и сагиттальные швы.
- Обнажите точки Лямбда и Брегма, отодвинув хирургическим шпателем ткань, покрывающую череп
.- Выровняйте черепную коробку так, чтобы положения брегмы и лямбды находились в одной плоскости.
- Чтобы установить точку отсчета, используйте стереотаксическое устройство с установленной стеклянной трубкой, чтобы установить его прямо над Bregma. Это будет «ноль» для координат передне-задних и медиально-латеральных измерений.
- Установите точку интереса, переместив стереотаксическую монтировку в нужные координаты, запишите стереотаксические координаты и нарисуйте квадрат вокруг целевой области, который отметит место, где будет выполняться трепанация черепа.
- Используйте хирургическую бормашину со стерилизованной сверлкой вдоль отмеченного квадрата медленно, без давления, чтобы медленно удалить костный материал. Будьте осторожны и не сверлите слишком долго в одной и той же области, так как это приведет к выделению тепла и образованию повреждений коры головного мозга.
- Когда кость, разделяющая трепанацию черепа, станет достаточно тонкой, осторожно удалите черепной срез пинцетом, чтобы обнажить кору.
- Часто орошайте обнаженную кору головного мозга искусственной спинномозговой жидкостью, чтобы предотвратить высыхание тканей.
ПРИМЕЧАНИЕ: Удаление твердой мозговой оболочки крысе не требуется, так как кончик инъектрода достаточно прочный, чтобы проникнуть внутрь.
3. Заполнение и монтаж системы впрыска
- Заполните микрошприц объемом 5-10 мкл методом аспирации с минеральным маслом.
- Заполните иглу для подкожных инъекций неподвижной стеклянной пипеткой раствором 0,5% Chicago Sky Blue (CSB) и 300 μМ γ-аминомасляной кислоты (ГАМК) или раствором 2% лидокаина с 0,5% CSB. Разбавьте все растворы физиологическим раствором.
- В случае обильного вещества, наполните его обычным шприцем и используйте обычные методы предосторожности, чтобы избежать образования пузырьков воздуха.
- В случае более дорогих веществ используйте минеральное масло для заполнения инжектора, после чего химическое вещество может быть введено путем аспирации. Поскольку разница в плотности между минеральным маслом и водой относительно высока, это вещество является хорошим кандидатом для инъекции водных растворов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для подтверждения разделения между двумя жидкостями может быть добавлен краситель.
- Чтобы наполнить инъекционную пипетку, необходимо наполнить раствором шприц объемом 1 мл методом аспирации, а затем медленно ввести раствор в инъекционную пипетку.
- Обратите особое внимание на утечки в областях, указанных на рисунке 1, очистив эти участки и наблюдая за утечками, медленно вводя раствор с помощью шприца.
- Извлеките шприц объемом 1 мл. При этом обязательно сохраняйте легкое давление на поршень, чтобы вакуум не удалял раствор из инъекционной пипетки.
- Наполните микрошприц минеральным маслом методом аспирации и плотно приложите его к заполненной пипетке для инъекций, затем тщательно сотрите излишки раствора с собранного инжектора марлей.
- Убедитесь, что наконечник не заблокирован, введя очень небольшой объем, достаточный для того, чтобы на кончике стеклянной пипетки образовалась небольшая капля.
- Установите инжектор на систему микронасоса и убедитесь, что он хорошо закреплен.
- Осторожно расположите наконечник инжектора в целевых координатах и опустите наконечник к поверхности коры.
- Медленно опустите инжектор с помощью стереотаксического аппарата к целевой структуре (в данном случае верхнему холмику) с использованием соответствующих анатомических координат.
- Накройте обнаженную кору теплым агаром, чтобы предотвратить высыхание тканей.
4. Впрыск и обратимая инактивация
- Настройте насос микровпрыска на впрыск от 400 до 800 нл со скоростью 40 нл/мин и нажмите Run для начала впрыска. Обратите внимание, что скорость скачков будет снижаться во время инъекции.
ПРИМЕЧАНИЕ: В экспериментальной установке нейронная активность восстанавливалась в течение часа после окончания доставки ГАМК. Любое откалиброванное механическое устройство может быть использовано для оказания давления на шприц для микроинъекции с целью проведения инъекции. - После получения электрофизиологических данных следует провести эвтаназию с использованием метода, одобренного местным Комитетом по этике животных.