Ингибирование нейронной активности и ее выявление с помощью электрофизиологии у крысы

Аннотация

Источник: Lai, J., et al. Одновременная электрофизиологическая регистрация и микроинъекции ингибирующих агентов в мозг грызуна. J. Vis. Exp. (2015)

В этом видео демонстрируется основанная на микроинъекциях техника одновременной записи нейронов и ингибирования в верхнем колликулусе крысы. Процедура включает в себя стереотаксическое нацеливание, сверление черепа и введение инжектора, который доставляет ингибирующий нейромедиатор при записи нейронной активности. Световая стимуляция вызывает потенциалы действия, в то время как микроинъекции лекарств подавляют возбудимость нейронов. По мере снижения уровня нейротрансмиттеров активность нейронов возвращается к исходному уровню, что позволяет изучать как торможение, так и восстановление.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными моделями, были рассмотрены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным советом JoVE.

1. Сборка пипетки для записи и впрыска

1. Потяните стеклянный капилляр длиной около 7 см (внешний диаметр 1 мм) с помощью съемника для пипетки.
2. Разломайте кончик капилляра и проверьте отверстие под световым микроскопом. Убедитесь, что внутренний диаметр составляет от 30 мкм до 40 мкм.
3. Вставьте серебряную проволоку длиной 7 см в стеклянный капилляр с примерно 1 см, выступающей из неконического конца стеклянной пипетки.
4. Согните лишнюю нить перпендикулярно стеклянному капилляру.
5. Нанесите каплю гибкого пластичного клея на стержень иглы для подкожных инъекций 30 G.
6. Введите иглу для подкожных инъекций 30 G в стеклянную пипетку в соответствии со схемами, представленными на рисунке 1.
7. Добавьте второй слой клея, чтобы обеспечить надлежащую герметизацию от места соединения между стеклянной пипеткой и иглой для подкожных инъекций.
8. Дайте пипетке высохнуть кончиком вверх примерно на 12 часов, чтобы обеспечить надлежащее отверждение клея. Готовый результат показан на рисунке 2.

ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура проводится в ходе острых экспериментов и стерилизация наконечника пипетки не требуется.

2. Подготовка животного

1. животного Поместите крысу в бокс для анестезии.
2. Вызвать анестезию с помощью 4% изофлурана в течение 5-10 минут.
3. Поместите животное на стереотаксический стол с грелкой и ректальным зондом для поддержания температуры тела 37 °C. Используйте носовой конус для поддержания анестезии с 2% изофлураном. Закрепите голову крысы с помощью ушных упоров и держателя для зубов.
4. Нанесите офтальмологическую мазь или глазные капли, которые содержат 1% капли атропина, чтобы помочь расширению зрачка. Чтобы предотвратить сухость, наносите смазывающие капли примерно каждые 30 минут.
5. Побрейте голову и очистите ее 10% повидон-йодом.
6. Для местной анестезии введите 0,5 мл 2% лидокаина под волосистую часть головы в 2-3 местах, приподняв кожу вверх и вставив кончик иглы.
7. Подтвердите достаточный уровень анестезии, выполнив щипление пальца ноги и наблюдая за отсутствием движения. Кроме того, следите за частотой сердечных сокращений, чтобы убедиться, что она находится в пределах нормы (от 300 до 400 уд/мин).
8. Надрежьте кожу головы по прямой линии вдоль срединной линии лезвием скальпеля #10, чтобы обнажить как корональные, так и сагиттальные швы.
9. Обнажите точки Лямбда и Брегма, отодвинув хирургическим шпателем ткань, покрывающую череп
.
10. Выровняйте черепную коробку так, чтобы положения брегмы и лямбды находились в одной плоскости.
11. Чтобы установить точку отсчета, используйте стереотаксическое устройство с установленной стеклянной трубкой, чтобы установить его прямо над Bregma. Это будет «ноль» для координат передне-задних и медиально-латеральных измерений.
12. Установите точку интереса, переместив стереотаксическую монтировку в нужные координаты, запишите стереотаксические координаты и нарисуйте квадрат вокруг целевой области, который отметит место, где будет выполняться трепанация черепа.
13. Используйте хирургическую бормашину со стерилизованной сверлкой вдоль отмеченного квадрата медленно, без давления, чтобы медленно удалить костный материал. Будьте осторожны и не сверлите слишком долго в одной и той же области, так как это приведет к выделению тепла и образованию повреждений коры головного мозга.
14. Когда кость, разделяющая трепанацию черепа, станет достаточно тонкой, осторожно удалите черепной срез пинцетом, чтобы обнажить кору.
15. Часто орошайте обнаженную кору головного мозга искусственной спинномозговой жидкостью, чтобы предотвратить высыхание тканей.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Удаление твердой мозговой оболочки крысе не требуется, так как кончик инъектрода достаточно прочный, чтобы проникнуть внутрь.

3. Заполнение и монтаж системы впрыска

1. Заполните микрошприц объемом 5-10 мкл методом аспирации с минеральным маслом.
2. Заполните иглу для подкожных инъекций неподвижной стеклянной пипеткой раствором 0,5% Chicago Sky Blue (CSB) и 300 μМ γ-аминомасляной кислоты (ГАМК) или раствором 2% лидокаина с 0,5% CSB. Разбавьте все растворы физиологическим раствором.
   1. В случае обильного вещества, наполните его обычным шприцем и используйте обычные методы предосторожности, чтобы избежать образования пузырьков воздуха.
   2. В случае более дорогих веществ используйте минеральное масло для заполнения инжектора, после чего химическое вещество может быть введено путем аспирации. Поскольку разница в плотности между минеральным маслом и водой относительно высока, это вещество является хорошим кандидатом для инъекции водных растворов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для подтверждения разделения между двумя жидкостями может быть добавлен краситель.
3. Чтобы наполнить инъекционную пипетку, необходимо наполнить раствором шприц объемом 1 мл методом аспирации, а затем медленно ввести раствор в инъекционную пипетку.
4. Обратите особое внимание на утечки в областях, указанных на рисунке 1, очистив эти участки и наблюдая за утечками, медленно вводя раствор с помощью шприца.
5. Извлеките шприц объемом 1 мл. При этом обязательно сохраняйте легкое давление на поршень, чтобы вакуум не удалял раствор из инъекционной пипетки.
6. Наполните микрошприц минеральным маслом методом аспирации и плотно приложите его к заполненной пипетке для инъекций, затем тщательно сотрите излишки раствора с собранного инжектора марлей.
7. Убедитесь, что наконечник не заблокирован, введя очень небольшой объем, достаточный для того, чтобы на кончике стеклянной пипетки образовалась небольшая капля.
8. Установите инжектор на систему микронасоса и убедитесь, что он хорошо закреплен.
9. Осторожно расположите наконечник инжектора в целевых координатах и опустите наконечник к поверхности коры.
10. Медленно опустите инжектор с помощью стереотаксического аппарата к целевой структуре (в данном случае верхнему холмику) с использованием соответствующих анатомических координат.
11. Накройте обнаженную кору теплым агаром, чтобы предотвратить высыхание тканей.

4. Впрыск и обратимая инактивация

1. Настройте насос микровпрыска на впрыск от 400 до 800 нл со скоростью 40 нл/мин и нажмите Run для начала впрыска. Обратите внимание, что скорость скачков будет снижаться во время инъекции.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В экспериментальной установке нейронная активность восстанавливалась в течение часа после окончания доставки ГАМК. Любое откалиброванное механическое устройство может быть использовано для оказания давления на шприц для микроинъекции с целью проведения инъекции.
2. После получения электрофизиологических данных следует провести эвтаназию с использованием метода, одобренного местным Комитетом по этике животных.

Результаты

Рисунок 1: Схематическое изображение инжекторовой сборки. Микрошприц (А) прикреплен к пипетке для записи и инъекций, которая состоит из иглы для подкожных инъекций (В) массой 30 г, прикрепленной к серебряной п...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Инъекционный насос (UltraMicroPump III)	WPI
Инъекционная консоль (контроллер Micro4)	WPI	#SYS-MICRO4
Шприц Hamilton	Hamliton	(80301) 701LT 10 μL SYR	Используемые шприцы от 5 до 10 μл Гель
цианоакрилатный адгезив	Krazy Glue	KG86648R	Гелевую форму легче наносить на стержень иглы для подкожных инъекций 30G
Стеклянные пипетки	WPI	#TW100F-4	Тонкие стенки, 1 мм OD, 0,75 мм ID с филаментными пипетками Используемые пипетки
720 Игла Пипетки Puller	Kopf	720
Silver wire	A-M Systems, Inc.	782500	Голый 0.010"

#UMP3