Субпиальная доставка генов в спинной мозг мыши для оценки экспрессии генов

Аннотация

Источник: Tadokoro, T., et al. Доставка вектора субпиального аденоассоциированного вируса 9 (AAV9) взрослым мышам. J. Vis. Exp. (2017)

В этом видео демонстрируется техника субпиальной инъекции для доставки генов в спинной мозг у мышей. Процедура включает в себя обнажение твердой мозговой оболочки, прокол твердой мозговой оболочки и введение рекомбинантного аденоассоциированного вируса (rAAV), несущего ген, экспрессирующий флуоресцентный белок, в субпиальное пространство. После инъекции и выздоровления вирус способствует экспрессии генов в клетках спинного мозга, что позволяет изучать экспрессию генов-мишеней.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными моделями, были рассмотрены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным советом JoVE.

1. Общая подготовка животных и хирургическое вмешательство

1. перед началом хирургической процедуры разморозьте вирус (AAV9-UBI-GFP [UBI: Ubiquitin Promoter, GFP: Green Fluorescent Protein]; 5 мкл аликвот). Приготовьте 5% раствор декстрана (10 000 МВт), смешав порошок декстрана с дистиллированной водой. Смешайте раствор вируса с 5% раствором декстрана 1:1 до конечной концентрации декстрана 2,5%.
   1. Храните вирусный раствор на льду (4 °C).
2. Используйте взрослых мышей C57BL/6J (самцы и самки, 20-30 г). Обезболивайте мышей с помощью 5% изофлурана (в O₂, 1 л/мин) и поддерживайте их на уровне 2-3% ингаляционного изофлурана (в O₂, 1 л/мин) с помощью носового конуса во время операции, в зависимости от частоты дыхания и реакции на щипывание лапы.
3. Побрейте спину животных ножницами для бритья и очистите кожу 2% хлоргексидином.
4. При исследованиях по лечению хронических заболеваний следует придерживаться строгой стерильной техники.
5. Если необходимо выполнить поясничные субпиальные инъекции, разрежьте скальпелем кожу, покрывающую позвонки Th8-L1, и отделите паравертебральную мышцу от спинных позвонков Th10-12 с помощью ножниц.
   1. Установите животное в стандартную стереотаксическую рамку с помощью спинальных зажимов мыши.
   2. Сбрейте обе стороны пластинки позвонков Th10-12 с помощью стоматологической бормашины (сверло: 0,9 мм, скорость: 20 000 об/мин) до появления трещин.
   3. Удалите треснувшие костные отломки щипцами и обнажите тыльную поверхность поясничного отдела спинного мозга.
   4. Разрежьте твердую мозговую оболочку примерно на 1 см с помощью иглы из нержавеющей стали 30 G и щипцов.

2. Вскрытие мембраны пиала и введение субпиальной иглы для доставки AAV9

1. Установите иглу 34 G для проникновения в Z-образный рычаг манипулятора XYZ с помощью держателя стеклянного капилляра (Рис. 1A и B).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для изготовления иглы для проникновения в пиа оригинальный скошенный наконечник иглы 34G затачивается с помощью стеклянного капиллярного скоса с алмазной абразивной пластиной - грубой (от 5,0 мкм до 50 мкм размеры) и угол шлифования 15 - 20°. Затем кончик иглы (длина 1 мм, измеренная от кончика) затем осторожно сгибается примерно на 90° (Рисунок 1B, левая вставка).
2. С помощью хирургического препарирующего эндоскопа, установленного на 8-10-кратное увеличение, проникните в pia иглой для проникновения примерно на 1 мм (рис. 1C) с помощью X-дуги.
   1. Держите угол проникающей иглы к поверхности ткани 5-10°.
3. После вскрытия пиа извлеките иглу, проникающую в пиа, горизонтально из субпиального пространства (Рисунок 1D) с помощью X-arm.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Запомните место проникновения ориентиром, таким как кровеносный сосуд.
4. Загрузите в тупую инъекционную иглу 36G вирус AAV9-UBI-GFP с помощью микрошприца объемом 50 мкл, подключенного к игле для инъекций с помощью трубки PE-10 или PE-20.
5. Установите иглу в Z-образный рычаг второго манипулятора XYZ (Рисунок 1A и B) с помощью стеклянного капиллярного держателя (Рисунок 1B, правая вставка).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для изготовления субпильной инъекционной иглы AAV9 тупой кончик иглы 36 G полируется с помощью стеклянного капиллярного скоса с алмазной абразивной пластиной - грубой (размеры наконечника от 5,0 мкм до 50 мкм) для удаления острых краев. Затем кончик иглы (длина 2-3 мм, измеряемая от кончика) затем осторожно сгибается примерно на 90°. Проникающие и субпиальные инъекционные иглы вставляются в ведомую трубку из нержавеющей стали 20G длиной 1-2 см (10 мм от конца иглы) и склеиваются эпоксидной смолой. Для надежного крепления к стеклянному капиллярному держателю требуется использование трубки диаметром 20 G (0,91 мм).
6. Манипулируя плечами X, Y и Z второго манипулятора, поместите кончик инъекционной иглы AAV9 в место, где проникает pia, а затем продвинуте его примерно на 2-3 мм в субпиальное пространство через предыдущее отверстие пиальной мембраны с помощью X-руки (рис. 1E и F).
   ПРИМЕЧАНИЕ: 1) AAV9-UBI-GFP получают в соответствии с ранее описанными протоколами, а окончательные титры корректируются до 1,2 x^{10 13} копий генома на мл (гc/мл). 2) Нет необходимости отмечать место отверстия пиаля, потому что его легко идентифицировать (Рисунок 1D).
7. Введите AAV9-UBI-GFP (1,5, 3 или 5 мкл) в субпиальное пространство с помощью микрошприца объемом 50 мкл (см. Таблицу 1 для экспериментальных групп).
8. Извлеките иглу для инъекций из подкожного пространства после завершения инъекции AAV9-UBI-GFP.
9. Закройте мышцы и кожу с помощью монофиламентного шовного материала 4.0 и хирургических зажимов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Нет необходимости герметизировать открытый позвонок.
10. Дайте животным восстановиться на грелке.
11. Для контроля боли вводите бупренорфин в дозе 0,05 мг/кг/ск каждые 12 ч в течение 2-3 дней после операции.

Таблица 1: Экспериментальные группы. Все эксперименты проводились на взрослых мышах C57BL/6J.

Экспериментальные группы	Место/уровень доставки AAV9 (*)	Объем AAV9 inj, скорость инфузии	Время выживания	Анализ тканей
Группа A (n = 7)	C2 (двусторонняя)	5 μL/5 min	14 дней	Головной + спинной мозг
Группа B (n = 12)	L1-L2 (двусторонняя)	1,5 мкл или 3 мкл, 60 сек/л	14 дней	Головной + спинной мозг
Группа C (n = 6)	C2 + L1-L2 (двусторонние на каждом уровне)	5 мкл/5 мин	14 дней	Спинной мозг
* - двусторонняя = выполняются две субпиальные инъекции, одна в правое и одна в левое субпиальное пространство инъецируемого сегмента (сегментов).

Результаты

Рисунок 1: Экспериментальная установка для выполнения спинальных субпиальных инъекций взрослой мыши. (A) Для выполнения спинальных субпиальных инъекций взрослым мышам используются два отдельных манипулятора X...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
C57BL/6J Мыши	Jackson Labs	664
Lab Standard Stereotaxic для мышей	Harvard Apparatus	72-9568
Мышиный спинальный адаптер	Harvard Apparatus	72-4811
XYZ Манипулятор	Stoelting	51604
Ручной инфузионный насос	Stoelting	51218
34G Скошенная игла Nanofill World	Precision Instruments	NF34BV-2
36G Тупая игла Nanofill	World Precision Instruments	NF-36BL-2
Fluriso, изофлуран	MWI Veterinary Supply	502017
Раствор хлоргексидина	MWI Veterinary	Supply 501027
20Г Игла из нержавеющей стали	Becton-Dickinson	305175
23G Игла из нержавеющей стали	Becton-Dickinson	305145
30G Игла из нержавеющей стали	Becton-Dickinson	305128
Аппликатор	с ватным наконечникомMWI Veterinary Supply	27426
Стеклянная капиллярная фаска	Narishige International	SM-25B
Слайдовый микроскоп Superfrost	Leica Microsystems	M80
50 мкл Микрошприц	Hamilton	81242
BD Intramedic PE-20 Трубка	Becton, Dickinson	427406
BD Intramedic PE-10 Трубка	Becton, Dickinson	427401
4-0 Монофиламентный шовный материал	VetOne	V1D397
Стеклянный капиллярный скос	Narishige	Pipet Micro Grinder EG-40
5 мин Эпоксидная смола (эпоксидная прозрачная)	Devcon	14310
Dextran	Polysciences, Inc	19411
AAV9-UBC-GFP	Лаборатория ядра вирусных векторов UCSD