Все процедуры, связанные с животными моделями, были рассмотрены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным советом JoVE.
1. Имплантация защитного стекла
- : Аккуратно нанесите боросиликатное покровное стекло толщиной 3 мм на открытый шнур.
- Убедитесь, что агароза охлаждена до 39 °C. С помощью небольшого шпателя нанесите теплую 2% агарозу/aCSF (искусственную спинномозговую жидкость) на край покровного стекла и позвольте капиллярному действию втянуть ее под поверхность.
Примечание: При температуре ниже 39 °C агароза может начать гелеобразствовать. Если это произошло, согрейте с помощью водяной бани или микроволновой печи. Некоторые операторы предпочитают сначала нанести одну каплю агарозы и уложить сверху покровное стекло. - Нанесите тканевый адгезив на обнаженные костные суставные отростки неповрежденных прилегающих позвонков на грудном уровне 11 позвоночного отдела позвоночника и грудном уровне 13 позвоночного сегмента позвоночника. Нанесите дополнительный тканевый адгезив в виде кольца вокруг места ламинэктомии, над прилегающим сухожилием и поперечным отростком.
Примечание: Тканевый адгезив необходим для правильного прилегания к стоматологическому цементу на последующих этапах. Суставные отростки образуют естественное посадочное место, на которое может устойчиво опираться затыльная пластина (рисунок 1). Сращивание с суставными отростками сформирует самые сильные точки прикрепления. - Смешайте стоматологический цемент с ускорителем в фарфоровой смесительной ванночке. С помощью небольшого шпателя перенесите стоматологический цемент на тканевый адгезивный слой. С помощью стоматологического цемента приклейте заднюю пластину к операционному полю, расположенному по центру окна. Подождите 10 минут, чтобы стоматологический цемент затвердел.
Примечание: Прочное сцепление задней пластины с передним и задним суставными отростками обеспечивает фундаментальную структурную стабильность имплантата. - Используйте дополнительный стоматологический цемент для заполнения внутренней основы задней пластины и нижней стороны задней пластины: тканевый интерфейс.
Примечание: Дополнительное нанесение стоматологического цемента улучшает адгезию и снижает риск утечки жидкости для погружения в объектив микроскопа (физиологического раствора) из нижней части задней пластины. - Переместите держатель вилочной задней пластины в соответствующее положение над окном. Закрепите заднюю пластину в держателе задней пластины с помощью винтов.
Примечание: В этом протоколе использовался специально изготовленный держатель задней пластины (рис. 2G\u2012H). - Нанесите физиологический раствор на заднюю пластину, чтобы проверить на утечку. Если жидкость вытекает, высушите эту область и нанесите больше стоматологического цемента.
2. Подготовка к визуализации
- Перенесите животное на хирургическую платформу на оптический стол.
Примечание: Наша хирургическая платформа, держатель задней пластины и держатель носового конуса изофлурана могут транспортироваться между хирургическими станциями и станциями двухфотонной визуализации как единое целое при применении непрерывной изофлурановой анестезии (Рисунок 2D, H). Подобные узлы могут быть собраны из опорных вил, балок и опорных столбов, которые можно получить из коммерческих источников (например, ThorLabs). Для прижизненной микроскопии зазор между объективом микроскопа и оптическим столом должен составлять не менее 11 дюймов, чтобы соответствовать высоте хирургической платформы. - Прикрепите хирургическую платформу к оптическому столу с помощью монтажного штифта из нержавеющей стали и заточенной зажимной вилки.
- Нанесите свежий физиологический раствор в лунку задней пластины. Опустите в колодец водопогружную линзу.
- Используйте проходящий или эпифлуоресцентный свет для определения области интереса и фокусировки. Переключитесь в режим лазерного сканирования и выполняйте визуализацию in vivo в соответствии с соответствующими двухфотонными лазерными фильтрами возбуждения длины волны, дихроичного и полосового фильтров для флуорофоров, присутствующих в ткани6.
