Внутривенная доставка блокаторов рецепторов для уменьшения отека мозга на мышиной модели

Аннотация

Источник: Zeynalov, E. et al., Непрерывная внутривенная инфузия является предпочтительным методом лечения блокатора рецепторов аргинин-вазопрессина Conivaptan у мышей для изучения отека мозга, вызванного инсультом. J. Vis. Exp. (2016)

В этом видео демонстрируется внутривенная доставка антагониста рецепторов аргинин-вазопрессина (AVP) на мышиной модели. Транзиторная окклюзия средней мозговой артерии вызывает отек мозга. Антагонист рецептора AVP вводится через катетер в левую яремную вену, облегчая отек.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными моделями, были рассмотрены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным советом JoVE.

1. Перед операцией Stroke Induction in vivo

1. предварительно покройте нить зубной смолой.
   1. Вырежьте кусок нити длиной 12 мм из нейлонового шва 7-0. Смешайте 2 части смолы с 1 частью отвердителя, а затем сразу же окуните кончик нити в смесь, чтобы покрыть примерно 1/3 всей длины. Быстро снимите его и убедитесь, что он покрыт гладким слоем стоматологической смолы.
   2. Перед использованием нить высушить на воздухе в течение 2 часов.
2. Поместите мышь в индукционную камеру для анестезии (объемом 2 л) и установите поток 1,5% изофлурана в 25% обогащенном кислородом комнатном воздухе со скоростью 2 л/мин при поступлении в камеру.
3. Дайте мыши оставаться в индукционной камере до тех пор, пока она полностью не обезболится, что определяется отсутствием реакции на защемление хвоста.
4. Положите мышь на операционный стол с помощью нагревательной салфетки и установите концентрацию изофлурана на 1% для поддержания анестезии, спонтанно введенной через носовой конус
.
5. Подстригите волосы на передней и задней части шеи и сбрызните шею медицинским спиртом. Нанесите ветеринарную офтальмологическую мазь на оба глаза.
6. Для непрерывного контроля температуры тела используйте ректальный датчик температуры, подключенный к цифровому дисплею во время операции.
7. Поместите мышь в положение лежа на спине, нанесите 10% раствор для дезинфекции повидон-йода, накройте стерильной простыней, а затем сделайте разрез по средней линии вдоль шеи хирургическим лезвием скальпеля 10 размера.
8. Временно перевязать левую общую сонную артерию (ОСА) шелковым швом 6,0.
9. Наложите еще одну завязку на левую наружную сонную артерию (ЭКА).
10. Поместите микрососудистый зажим на внутреннюю сонную артерию (ВСА).
11. Вырежьте небольшое отверстие на наружной сонной артерии микрососудистыми ножницами. Вставьте филамент из нейлонового шовного материала 7-0, покрытого стоматологической смолой, в отверстие в ЭХА, и продвигайте его цефалально, снимая зажим, до тех пор, пока не почувствуется сопротивление (примерно в 5-7 мм от точки бифуркации ОСА).
12. Наложите временную завязку на внутреннюю сонную артерию, чтобы зафиксировать нить на месте. Обратитесь к схеме, рисунок 1А. Закройте кожу шелковым швом, и пропитайте рану на передней части шеи 0,2 мл 0,5% бупивакаина, как в шаге 2.6.
13. Дайте мыши очнуться от анестезии и прийти в сознание в восстановительной камере в течение 60 минут. Не оставляйте животное без присмотра до тех пор, пока оно не придет в сознание, достаточное для поддержания лежачего положения на грудине.
14. Протестируйте мышь на оценку неврологического дефицита (NDS) следующим образом: 0 = нормальная двигательная функция, 1 = сгибание туловища и контралатеральной передней конечности при подъеме хвоста, 2 = вращение в контралатеральную сторону, но нормальное положение в покое, 3 = наклон в контралатеральную сторону в покое, 4 = отсутствие спонтанной двигательной активности.
    1. Для тестирования NDS поднимите мышь за хвост и положите ее на плоскую поверхность для наблюдения (2-3 минуты). В качестве альтернативы можно наблюдать за мышами в восстановительной камере. Исключить из эксперимента мышей с NDS ниже 2 из-за недостаточной окклюзии средней сонной артерии (МКА).
       ПРИМЕЧАНИЕ: Метод лазерной допплеровской флоуметрии может быть использован для подтверждения окклюзии MCA.
15. Повторно обезболите животное через 60 минут восстановления в индукционной камере, как описано выше, повторно простерилизуйте предыдущий разрез кожи 10% раствором повидон-йодного скраба и вновь откройте операционную рану на передней части шеи, разрезав и удалив шелковый шов.
16. Чтобы извлечь нить из ECA, выполните следующие действия:
    1. Поместите микрососудистый зажим на ICA. Развяжите шов на ВСА и вытяните нить, держа зажим открытым.
    2. Закройте зажим и наденьте стяжку на ECA проксимально к месту разреза.
    3. Извлеките зажим и лигатуру из ОСА, чтобы восстановить приток крови к мозгу. Обратитесь к диаграмме, рисунок 1B.

2. Установка внутривенного (IV) катетера в яремную вену для непрерывного лечения в течение 48 часов

ПРИМЕЧАНИЕ: Приступайте к установке катетера сразу после шага 1.16.3, не будя мышь.

1. Используйте гибкие трубки двух разных размеров: вставьте внутреннюю трубку (наружный диаметр 0,94 мм; для удержания вводимого препарата) во внешнюю трубку (наружный диаметр 3,18 мм; для защиты внутренней трубки).
2. Поместите мышь в положение лежа, нанесите 10% раствор повидон-йодного скраба для дезинфекции и сделайте разрез 1 см на задней части шеи хирургическим лезвием скальпеля размера 10. Переверните мышь в лежачее положение, повторно простерилизуйте переднюю часть шеи 10% раствором повидон-йодного скраба и вновь откройте операционную рану на передней части шеи. Туннель трубки проложите под кожей от разреза, сделанного на задней стороне, к передней части шеи, и выведите ее наружу из открытой раны на 1 см.
3. Удалите подкожную жировую клетчатку с левой стороны передней части шеи примерно на 1 см латерально от средней линии. Найдите левую яремную вену, поместите две завязки вдоль вены на расстоянии 5 мм друг от друга, и слегка растяните вену. Сделайте небольшое отверстие в яремной вене между двумя узами с помощью микрососудистых ножниц; Вставьте кончик внутренней трубки на глубину 5 мм каудально (по направлению к сердцу).
4. Закрепите трубку обоими завязками на яремной вене. Закройте кожу на передней части шеи шелковым швом 3-0. Обратитесь к схеме, рисунок 1С.
5. Закрепите трубку на коже на задней части шеи с помощью шва и подсоедините трубку к внутривенному насосу для микроинфузии с помощью вертлюга. Вертлюг позволяет мышам свободно перемещаться внутри клетки с полным доступом к пище и воде.
6. Инфильтрируйте разрезы кожи спереди и сзади шеи с помощью 0,2 мл 0,5% бупивакаина для предотвращения послеоперационной боли.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от протоколов для животных, специфичных для конкретного учреждения, животных можно лечить опиоидами, нестероидными противовоспалительными препаратами (НПВП) или антибиотиками до и после операции. Тем не менее, упомянутые методы лечения могут изменить результаты исхода ишемического инсульта.
7. Дайте животному проснуться в восстановительной камере, а затем поместите животное в отдельную клетку до окончания эксперимента. Не оставляйте животное без присмотра до тех пор, пока оно не придет в сознание, достаточное для поддержания лежачего положения на грудине.
8. Установите скорость инфузии для непрерывного 48-часового внутривенного введения кониваптана (0,14 мг/мл в 5% декстрозе) или средства на уровне 1,5 мл/кг/ч и начните инфузию.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Общее количество кониваптана, вводимого внутривенно, должно составлять примерно 0,2 мг/мышь/день в общем объеме 1,44 мл.

Результаты

Рисунок 1: Схема экспериментальной модели инсульта, установки внутривенного катетера и репрезентативного объема инфаркта через 48 часов после инсульта. Положение нити (показано синим цветом), предварительно покрытой смолой (зеленым) в лев...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Нагревательная прокладка	K&H Manufacturing Inc	1060
Монитор температуры с ректальным зондом	Physitemp	7029
Катушка для шелковых швов, 6-0	Surgical Specialties Corporation	SP114
Шелковый шов на иглу, 3-0	Ethicon	1684G
Нейлоновый шовный материал, 7-0	Ethicon	1696G
Стоматологическая смола полисилоксан с отвердителем	Heraeus Kulzer	65817930
Микроинфузионный внутривенный насос	Kent Scietific	GT0897
Swivel 22GA	Instech	375/22PS
Лабораторная трубка, 0,94 x 0,51 мм	Dow Corning	508-002
Лабораторная трубка, 3,18 x 1,98 мм	Dow Corning	508-009