Все процедуры, связанные с животными моделями, были рассмотрены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным советом JoVE.
1. Введение факторов перепрограммирования в
- установку мозга животного, стереотаксическое размещение и бурениеПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол фокусируется на использовании Ascl1, Lmx1a и Nurr1 (ALN) для перепрограммирования глии NG2 (нейрон-глиальный антиген 2) в интернейроны. По нашему опыту, интернейроны подобного фенотипа могут быть получены с помощью других комбинаций факторов
- Переместите руку M/L-D/V стереотаксической рамы на место (над животным) и закрепите ее.
ПРИМЕЧАНИЕ: Стереотаксическая рамка позволяет регулировать шприц по переднему/заднему (ось A/P, Y), медиальному/латеральному (M/L, ось X), и дорсальная/вентральная ось (ось D/V, Z). - Переместите шприц вдоль другой оси стереотаксической рамы, чтобы кончик стеклянного капилляра находился чуть выше брегмы (точки соединения, где встречаются различные пластины черепа).
- Убедитесь, что кончик капилляра идеально выпрямлен как в плоскости A/P, так и в плоскости M/L. При неоднозначной брегме берут среднее значение боковых и срединных швов.
- Когда кончик капилляра правильно расположен над брегмой, сбросьте значения M/L и A/P на 0,0 на цифровом счетчике координат.
- Чтобы убедиться, что голова животного находится в идеально ровном положении, используйте цифровой счетчик координат для измерения значения координат D/V, когда A/P плечо находится в значениях +2,0 и -2,0 (M/L = 0,0), а также когда M/L плечо находится в значениях +2,0 и -2,0 (A/P = 0,0). Соответственно отрегулируйте высоту зубчатого стержня и ушных брусьев.
- Переместите шприц в нужные координаты для введения вирусных векторов в полосатое тело (A/P = +1,0; M/L = -2.0, относительно брегмы).
- Слегка приподнимите шприц и, посмотрев на место инъекции в микроскоп, просверлите отверстие с помощью бормашины в точке с координатами инъекции. Начинайте сверлить на месте, работая по кругу и аккуратно.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не оказывайте слишком большого давления вниз, так как сверло должно быть достаточно острым, чтобы проходить через кость без дополнительного усилия. Избегайте длительного, продолжительного сверления, так как при этом выделяется тепло. - В конце сверления убедитесь, что твердая мозговая оболочка остается неповрежденной и открытой для инъекции.
- Подготовка к установке шприца
- Поместите кусок ватной марли на открытый разрез и промойте шприц физиологическим раствором.
- После промывки наберите пузырьки воздуха объемом 1–2 мкл, а затем 1 мкл раствора, содержащего вирусные векторы, избегая непреднамеренных пузырьков. Убедитесь, что вирусный раствор можно легко визуализировать под пузырьком воздуха во время инъекции.
- Viral injection
- Снимите ватную марлю с места разреза и опустите шприц с помощью D/V рычага стереотаксической рамки. По мере приближения к поверхности черепа внимательно посмотрите в микроскоп и измерьте D/V уровень твердой мозговой оболочки — она должна немного выпячиваться при слабом давлении.
- Касаясь твердой мозговой оболочки кончиком капилляра, установите координату D/V на 0,0.
- Опустите шприц, медленно продвигаясь на нужную глубину (D/V = -2,7, относительно твердой мозговой оболочки). Убедитесь, что траектория свободна от костных фрагментов, чтобы не наблюдалось изгиба иглы/капилляра.
ПРИМЕЧАНИЕ: Представленные координаты относятся к инъекции факторов перепрограммирования в стриатум мышей NG2-Cre. Могут использоваться координаты, соответствующие другим областям мозга. Всегда проверяйте координаты для инъекции сначала с помощью красителя (например, Trypan Blue), цветной бусины или репортерного вирусного вектора, прежде чем вводить перепрограммирующие факторы в мозг нового штамма мыши. При введении Трипана Блю, животных нужно принести в жертву сразу после операции, а мозг вскрыть. Свежие мозги могут быть разрезаны с помощью микротома, в то время как они заморожены, а место инъекции определяется путем визуализации положения красителя в мозге. Если тестировать координаты с помощью цветных бусин, то можно определить место инъекции по перфузии и порезанному мозгу через неделю после инъекции. В качестве альтернативы можно использовать инъекцию вирусного вектора, несущего репортерный ген, и определить место инъекции в перфузированном разрезанном мозге. - Введите 1 мкл вирусного раствора со скоростью 0,4 мкл/мин. Когда будет введен весь объем, дайте время на диффузию в течение 2 минут перед выводом шприца.
- После диффузии медленно втяните шприц до тех пор, пока кончик капилляра полностью не выйдет из мозга.
- Наложите на рану кусочек ватной марли и промойте шприц солевым раствором.
- Переместите рычаг M/L-D/V стереотаксической рамы за пределы рабочей зоны.
- Закрытие раны и послеоперационные процедуры
- Тщательно зашить разрез с помощью шовной нити.
ПРИМЕЧАНИЕ: Все нити для наложения швов, используемые у инъекционных животных, должны быть утилизированы в чашке/флаконе, содержащем противовирусный раствор моющего средства. Этот же раствор используется для очистки всех поверхностей вокруг зоны операции, которые контактировали с хирургическими материалами. Все хирургические инструменты тщательно промываются и автоклавируются в конце каждого операционного дня. - Извлеките животное из стереотаксической рамки и поместите его в послеоперационную станцию, которая включает в себя чистую, отапливаемую клетку, доступ к еде и воде, и где животное остается до полного пробуждения. В течение этого периода внимательно наблюдайте за животным до тех пор, пока оно не придет в сознание.
- Не размещайте прооперированных животных вместе с неоперированными животными до тех пор, пока они полностью не восстановятся после операции.
- Ежедневно присматривайте за прооперированными животными. В зависимости от используемых швов убедитесь, что они сняты при необходимости. Всем животным вводили бупенорфин (Temgesic в концентрации 1 мл/кг) подкожно в качестве послеоперационного ухода.
ПРИМЕЧАНИЕ: При работе с использованием одного и того же шприца в течение двух дней подряд промойте его водой, затем этанолом 70% и снова водой. Оставьте шприц, наполненный водой, на ночь, чтобы дать возможность раствориться любым возможным остаткам.