Электрофоретическая доставка ГАМК в эпилептический очаг мыши, находящейся под наркозом

Аннотация

Источник: Slezia, A. et al. Электрофоретическая доставка γ-аминомасляной кислоты (ГАМК) в эпилептический очаг предотвращает судороги у мышей. J. Vis. Exp. (2019)

В этом видео показана электрофоретическая доставка гамма-аминомасляной кислоты (ГАМК) для подавления судорожной активности у мышей, находящихся под наркозом. В нем описаны этапы, связанные с имплантацией зонда, регистрацией нейронной активности, индукцией судорог и контролируемой доставкой ГАМК с помощью микрофлюидного ионного насоса для оценки его терапевтической эффективности.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными моделями, были проверены местным комитетом по уходу за животными и ветеринарной экспертной комиссией JoVE.

1. Хирургия/Краниотомия

1. Фиксация головы мыши, находящейся под наркозом, в стереотаксической рамке. С помощью иглы 30 G введите местный анальгетик ропивакаин (5 μл, 7,5 мг/мл, см. Таблицу материалов) подкожно в планируемое место разреза. Подождите 5 минут, чтобы он подействовал.
2. Сделайте скальпелем прямую среднюю линию на коже над черепом. Аккуратно потяните кожу к бокам тонкими щипцами и зажмите ее в сторону бульдожьими зубчатыми зажимами, чтобы оставить череп открытым для дальнейшей работы.
3. Очистите череп от фасций с помощью скальпеля или любого подобного инструмента. При поверхностном кровотечении удалите кровь ватными палочками или небольшими кусочками бумажного полотенца.
4. Возьмите винт заземления с покрытием из поли(3,4-этилендиокситиофена) полистиролсульфоната (PEDOT:PSS) (размер: #00, диаметр: 0,047 дюйма, длина: 1/8 дюйма, см. Таблицу материалов) с припаянным проводом и подключите его с помощью разъема к головному устройству усилителя.
5. Увлажните череп в нужном месте отверстия и просверлите отверстие с высокой скоростью с помощью тонкого круглого сверла (диаметром 0,4 мм) на черепе над мозжечком, пока не станет видна твердая мозговая оболочка. Вставьте винт заземления в отверстие и вкрутите его точной отверткой, пока он не достигнет верхней части мозжечка.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Винт с головкой был покрыт погружением в раствор PEDOT:PSS, содержащий 1% 3-глицидилоксипропил)триметоксисилана (GOPS) по массе, с последующим запеканием при 140 °C в течение 90 мин. PEDOT:PSS представляет собой сопряженный полимер с объемной емкостью, который, как известно, является биосовместимым. GOPS представляет собой сшивающий агент в смеси с PEDOT:PSS для повышения стабильности в водных средах (Рисунок 1).
6. С помощью стереотаксической рамки измерьте стереотаксические координаты для нужной области мозга. Например, областью интереса является гиппокамп, переднезадний (AP) -1,8 мм и медиолатеральный (ML) 1,8 мм от точки Брегмы на основе атласа мозга мышей.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это координаты для правого полушария (рис. 1).
7. Утончите участок черепа диаметром примерно от 1 до 2 мм над целевой областью с помощью надежной стоматологической бормашины (см. Таблицу материалов), установленную на высокой скорости, пока не останется тонкая, хорошо отполированная, прозрачная костная мембрана.
8. Затем, если толщина костной оболочки достаточно тонкая (<200 мкм), сделайте небольшое отверстие тонкими щипцами и аккуратно удалите тонкий слой кости. Используйте изготовленную на заказ иглу с крючковым наконечником, чтобы удалить твердую мозговую оболочку. Сведите к минимуму размер трепанации черепа и дуротомии, чтобы предотвратить развитие отеков и свести к минимуму сердечную и/или дыхательную пульсацию мозга.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Трепанация черепа должна быть заполнена каплей физиологического раствора для предотвращения высыхания, а затем регулярно наполняться во время эксперимента (Рисунок 1).

2. Введение многоканального силиконового зонда

1. Используйте стереотаксические кронштейны под небольшим углом AP (20°), чтобы силиконовый зонд оставлял достаточно места для размещения двух других имплантатов и чтобы места записи и инъекции электрода, ионного насоса и микропипетки были как можно ближе.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Электроды, шприцы и ионные насосы покрывали каплей раствора красителя DiI (1,1'-диоктадецил-3,3,3',3'-тетраметилиндокарбоцианина перхлорат [DiI]) для апостериорной визуализации следов имплантации (0,5 мг/мл DiI в диметилсульфоксиде).
2. Поместите силиконовый щуп на стереотаксический кронштейн, прикрепленный к магнитному держателю, и поместите его рядом со стереотаксической рамой. Установите угол AP (20°), а затем подсоедините щуп к оголовке и к винту заземления.
3. Медленно опустите силиконовый зонд в гиппокамп с помощью стереотаксического манипулятора с точностью до микрона или моторизованного микроманипулятора, чтобы избежать боковых движений (рис. 1 и рис. 2).
   1. Запустите программное обеспечение для записи и запишите — с помощью головной сцены, подключенного усилителя и компьютера — электрические нейронные сигналы, перемещая многоканальный кремниевый зонд от вершины коры головного мозга до тех пор, пока не будет достигнуто целевое дорсовентральное (DV) положение (-1,800 μм от поверхности коры). Записывайте и наблюдайте за сигналом локального потенциала поля (LFP) во время проникновения на экране компьютера.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Контролируйте спуск зонда так, чтобы он двигался медленно и непрерывно во время записи, чтобы иметь лучший визуальный контроль за проникновением и достижением целевой зоны.
   2. Используйте пульсирующую активность в пирамидальном слое гиппокампа в зарегистрированном LFP в качестве маркера целевой зоны.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Пульсирующая активность видна на одном или двух соседних каналах многоканального кремниевого (Si) зонда, имеющего расстояние 100 мкм между местами записи (рис. 3).
   3. Одновременная запись сигналов LFP со слоев коры головного мозга и гиппокампа через программное обеспечение многоканального усилителя (см. таблицу материалов) с помощью многоканальных зондов Si (рис. 3).

3. Введение микрофлюидного ионного насоса (μFIP)

1. Подсоедините трубки (см. Таблицу материалов) к входу μFIP и заполните зонд 0,05 М раствором гамма-аминомасляной кислоты (ГАМК). Извлеките трубки и закройте входное отверстие парафиновой пленкой. Подключите электрические провода к источнику измерения источника.
2. Введите μFIP с помощью стереотаксического плеча под медиолатеральным (MP) углом (20°). Зонд Si остается вставленным в течение всего процесса.
   ПРИМЕЧАНИЕ: μFIP очень гибкий и может выиграть от поддержки небольшой и чистой кисти, чтобы держать его прямо до тех пор, пока он не достигнет поверхности мозга. После этого шага μFIP можно мягко опустить с помощью осевых движений.
3. Медленно опускайте μFIP осевыми движениями и никогда не позволяйте ему изгибаться во время траектории, пока он не достигнет дорсовентральной (DV) координаты (-1 200 μм от поверхности коры).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Старайтесь расположить два устройства (μFIP и кремниевый зонд) как можно ближе друг к другу, учитывая расстояние 300 мкм от выходного отверстия до наконечника μFIP.
   ВНИМАНИЕ: Избегайте механических проблем между устройствами и их разъемами во время установки (рис. 1B и рис. 2B).

4. Подготовка аппаратов для индукции судорог

1. Поменяйте металлическую иглу шприца (10 мкл) (см. Таблицу материалов). Снимите металлическую часть, удерживающую иглу, установите и зафиксируйте микропипетку (внешний диаметр [OD]: 1,2 мм, внутренний диаметр [ID]: 0,75 мм, диаметр наконечника: 20–50 мкм с ± 0,5 см сужения хвостовика), а затем установите на место игольчатый элемент.
2. Расположите шприц и прикрепленную к нему боросиликатную микропипетку под углом 20° латеромедиала (LM) для инъекции 4-аминопиридина (4AP) (50 мМ в искусственную спинномозговую жидкость [ACSF]).
   ВНИМАНИЕ: Не используйте металлическую иглу шприца или микропипетку с наконечником размером более 50 мкм.
3. Втягивайте 500 нл–1 мкл 50 мМ 4AP с помощью автоматизированного насоса микровпрыска.

5. Введение стеклянной пипетки, прикрепленной к шприцу для инъекции 4AP

1. Опустите стеклянную микропипетку, прикрепленную к шприцу, в положение намеченного DV (-1 500 мкм), а затем введите 250 нл раствора 4AP (рис. 1 и рис. 2). Начните запись с помощью программного обеспечения для записи. Следите за экраном и ждите, когда появится первый межприступный спайк.
2. Начните подачу ГАМК с помощью μFIP сразу после появления первого межприступного спайка. Подача ГАМК путем подачи напряжения 1 В между источником и целью в течение 100 с с последующим отключением на 1 с в течение 30 циклов. С помощью программного обеспечения для записи запишите минимум 2 ч.<бр />ПРИМЕЧАНИЕ: Общая масса доставляемой ГАМК составляет около 1 нмоль (Рисунок 4).
3. В конце эксперимента аккуратно извлеките вставленные щупы и винт заземления, а также извлеките животное из стереотаксического оборудования. Животных усыпляли с использованием передозировки препарата (i.p.100 мг/кг пентобарбитала). Смерть была подтверждена прекращением дыхания и кровообращения.

Результаты

Рисунок 1: Краниодуротомия и локализация имплантатов в мозге мыши. (А) Схематическое изображение операции, трепанации черепа и мишени имплантатов в мозге мыши. (B) Использовали стереотаксические координаты и у...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
4AP	Sigma	275875
Усилитель	Neuralynx, Монтана, США	Цифровой усилитель Lynx 4SX
	Ampliplex	KJE-1001
Atlas Stereotaxique	Allen Atlas	978-0470054086
Боросиликальный стеклянный пипетка	Sutter	BF120-69-15
Мозговая матрица	WPI	RBMA-200C
Костный триммер	FST	16109-14
Соединитель	INSTECH	SC20/15
Coton	tige Monoprix	EMD 6107OD
Чехол накладной	Menzel-Glass	15747592
DiI Морилка	Thermo Fisher	D282
DMSO	Sigma	11412-11
Сверло	FOREDOM	K1070
Щипцы	F.S.T.	11412-11
GABA	Sigma	A2129
GOPS	Sigma	440167-100M
Шприц Hamilton	Hamilton	80330
Головка винта	Компонент Поставка	TX00-2FH
Грелка	Гарвардский аппарат	341446
Инжекторный насос	WPI	UMP3-3
Keithley	Tektoronix	216A
Кетамин	Ренаудин	5787419
Магнитный держатель	Narishige	GJ-1
Мыши	Charles River	612
Моторный манипулятор	Scientifica, Великобритания	IVM
Динатрий водородный фосфат	Sigma	255793
Мононатрия дигидрофосфат	Sigma	7558807
NeuroTrace DiI	Thermofisher	N22880
Бумажное полотенце	KIMBERLY CLARK	7552000
PB	Sigma	P4417
PEDOT:PSS	CLEVIOS		81076212
PFA	Acros Organic	30525-89-4
Ректальный температурный зонд	Гарвардский аппарат	521591
Ropivacaine	KABI	1260216
физиологическим раствором	Sigma	7982
Скальпель	F.S.T	AUST
Seringue	BD Medical	324826
Рекомендуется использовать зажим Serrefine	F.S.T	18050-28	4
Силиконовый зонд	NeuroNexus, Мичиган, США	A2x16-10mm-50-500-177 или A1x16-5mm-150-703
Стереотоксичная рамка	Stoelting	51733U
Xylazine	Bayer	4007221032311

R195806