Упаковка с ВИЧ или FIV основе Lentivector Конструкции выражения и трансдукции VSV-G Pseudotyped вирусных частиц

Краткое содержание

Лентивирусов векторов экспрессии является наиболее эффективным средством стабильно, выражающих различные эффекторные молекулы или репортер конструкций в разделении и без деления клеток млекопитающих и целые организмы. Здесь мы предоставляем протокол о том, как упаковать lentivector конструкций выражение в pseudoviral частиц и преобразовывать клетки-мишени использованием pseudoviral частиц.

Аннотация

Как и в случае со стандартными плазмидными векторами, возможно трансфекция лентивекторов в плазмидной форме в клетки с низкой и средней эффективностью для получения переходной экспрессии эффекторов. Тем не менее, упаковка лентивирусных экспрессионных конструкций в псевдовирусные частицы обеспечивает до 100% трансдукции, даже с труднотрансфицируемыми клетками, такими как первичные, стволовые и дифференцированные клетки. Кроме того, доставка лентивируса не вызывает специфических клеточных реакций, обычно связанных с химическими трансфекциями, таких как гибель клеток в результате токсичности реагента для трансфекции ^{1, 2}. При трансдукции в клетки-мишени лентивирусная конструкция интегрируется в геномную ДНК и обеспечивает стабильную экспрессию малой шпилечной РНК (шРНК), кДНК, микроРНК или репортерного гена ^{3, 4}. Клетки-мишени, стабильно экспрессирующие эффекторную молекулу, могут быть выделены с помощью селективного маркера, содержащегося в конструкции вектора экспрессии, такого как пуромицин или GFP. После того как псевдовирусные частицы инфицируют клетки-мишени, они не могут реплицироваться в клетках-мишенях, поскольку вирусные структурные гены отсутствуют, а длинные концевые повторы (LTR) спроектированы таким образом, чтобы быть самоинактивирующимися при трансдукции ^{5, 6}.

Для эффективной упаковки лентивируса необходимы три основных компонента^{: 1, 5, 6, 7}.
1. Лентивирусный экспрессирующий вектор, содержащий некоторые генетические элементы, необходимые для упаковки, стабильной интеграции вирусной экспрессионной конструкции в геномную ДНК и экспрессии эффектора или репортера.
2. Лентивирусная упаковка плазмид, которые обеспечивают белки, необходимые для транскрипции и упаковки РНК-копии экспрессирующей конструкции в рекомбинантные псевдовирусные частицы. В этом протоколе используются плазмиды pPACK (SBI), которые кодируют gag, pol и rev из генома ВИЧ или FIV, а также белок g вирусного вируса стоматита (VSV-G) для белка вирусной оболочки.
3. Клетки-продуценты 293TN (полученные из клеток HEK293), экспрессирующие большой Т-антиген SV40, необходимый для производства лентивирусов с высоким титром, и ген устойчивости к неомицину, полезный для повторного отбора клеток для поддержания.

Обзор протокола производства вируса можно увидеть на рисунке 1. Производство вируса начинается с совместной трансфекции клеток-продуцентов 293TN с вектором экспрессии лентивируса и плазмидами упаковки. Вирусные частицы выделяются в среду. Через 48-72 часа собирают питательную среду для клеточных культур. Клеточный мусор удаляется из среды клеточных культур, а вирусные частицы осаждаются центрифугированием с помощью PEG-it для концентрирования. Полученные лентивирусные частицы затем титрируются и могут быть использованы для трансдукции клеток-мишеней. Подробная информация о вирусном титровании не включена в этот протокол, но ее можно найти по адресу:

http://www.systembio.com/downloads/global_titer_kit_web_090710.pdf ⁸.

Этот протокол был оптимизирован с использованием указанных конкретных продуктов. Другие реагенты могут быть заменены, но те же результаты не могут быть гарантированы.

Протокол

1. Трансфекция 293TN Клетки с упаковки плазмиды и выражений Построить

1. Семенной 7.0 - 8.0 х 10 ⁶ клеток на 293TN 15 см ² пластины культуры в 20 мл культуральной среде, содержащей DMEM среде с 4 мМ L-глутамина, 4,5 г / л, глюкоза, и эмбриональной телячьей сыворотки (10%) без антибиотиков. Расти в течение 18-24 часов при 37 ° C с 5% CO _2, так что плотность клеток достигает 60-80% слияния во время трансфекции. В некоторых случаях может оказаться необходимым, чтобы семена нескольких пластин клеток получить достаточно высокий титр для трансдукции клеток-мишеней.
2. Для каждой пластине клеток, добавляют 1,6 мл бессывороточной DMEM в автоклаве 2 трубками мл Eppendorff. Добавьте 45 мкл pPACKH1 или pPACKF1 и 4,5 мкг ваш lentivector построить в DMEM и перемешать с помощью пипетки вверх и вниз.
3. Добавить 55 мкл PureFection в ту же трубу. Vortex в течение 10 секунд. Инкубируйте DMEM-плазмиды-PureFection смесь при комнатной температуре еили 15 мин.
4. Добавить DMEM-плазмиды-PureFection смесь на плиту культуры тканей каплям и водоворот осторожно, чтобы равномерно рассеять по всему пластины. Вернуться блюдо в инкубатор и расти при температуре 37 ° C с 5% CO _2.
5. Существует нет необходимости менять СМИ после трансфекции. Если lentivector конструкция выражает ген, кодирующий флуоресцентный белок GFP, как, проверьте ваши клетки под микроскопом 12-24 часов после трансфекции. Вы должны быть в состоянии видеть> 90% GFP-положительных клеток, что указывает на трансфекции была успешной.
6. Соберите супернатант культуры клеток через 48 и 72 часов в 50 мл стерильной пробирке центрифуги. Это супернатант культуры клеток в настоящее время содержит инфекционных pseudoviral частиц. (Следовать рекомендациям руководства по работе с классом безопасности BSL-2). Центрифуга на 1500 мкг в течение 15 мин при комнатной температуре в гранулах сотовой мусора. Передача вирусной супернатант в новую пробирку, обеспечивая, чтобы не нарушить гранул.
7. 293TN клетки, которые были использованы для вирусной упаковку следует выбрасывать в контейнер для биологически опасных и не могут быть использованы для дальнейших раундов вирусной упаковке.

2. Концентрация вирусной Супернатант

1. Добавить 1 объем холодного (4 ° С) PEG-это вирус осадков Решение каждые 4 объема лентивирусов частиц содержащих супернатант. Осаждение лентивирусов частиц из больших объемов может быть достигнуто с Corning 250 мл полипропиленовые трубы центрифуги. Смешать решения путем обращения труб в несколько раз, но не вихрь смеси.
2. Охладите раствор при температуре 4 ° С в течение не менее 12 часов (до 4 дней приемлемо). Не трясите и не повернуть трубы в холодильной шаг.
3. Центрифуга супернатант / PEG-это смесь при 1500 мкг в течение 30 минут при 4 ° C. После центрифугирования лентивирусов частицы будет выглядеть как бежевый или белый шарик в нижней части трубы. Вылейте supernataNT.
4. Удалите все следы жидкости стремления, стараясь не нарушить осажденного лентивирусов частиц в гранулах. Следы остаточных PEG-это разбавить вирус (тем самым уменьшая титр), но не влияет на целостность клетки-мишени с PEG-он инертен и не токсичен.
5. Ресуспендируйте и объединить лентивирусов частиц в 1/100 первоначального объема с использованием холодного (4 ° С), стерильный фосфатный буферный раствор или DMEM, содержащей 25 мМ HEPES буфера.
6. Алиготе в стерильные флаконы и криогенных магазине при -70 ° С до готовности к использованию.

3. Вирусный Titering и трансдукция клеток-мишеней

1. Мы рекомендуем titering лентивирусов частиц до трансдукции клеток-мишеней, из интереса и расчета соответствующих множественности заражения (МВД) на клетки-мишени для согласованности между экспериментами. Для вирусного titering, мы рекомендуем использовать HT1080 клеток простой в заразить положительного контроля линии. Plпростота отметить, что протокол предполагает titering трансдуцирующих HT1080 клетки с небольшим аликвоту лентивирусов частиц вы упаковке. После титров известно, клетки-мишени интересов, также может быть трансдуцированных производится лентивирусов частиц. Рекомендуется titering протокола можно найти по адресу: http://www.systembio.com/downloads/manual_titer_kit_web.pdf ^7.
2. Пластина 50000 клеток-мишеней интересов, на лунку в 24-луночного планшета в средствах массовой культуре клеток. Использование средств массовой информации, что клетки, как правило, культивировали дюйма Рост клеток в течение ночи при определенных условиях их культуры. Клетки должны быть в пределах от 50 до 70% сливающийся в день трансдукции.
3. В день трансдукции, аспирации средства массовой информации от клетки. Комбинат питательной среде с TransDux до 1 х конечной концентрации (например, 2,5 мкл TransDux до 500 мкл питательной среды). Затем перенесите TransDux-сеLL смесь питательной среды в каждую лунку.
4. Пипетировать соответствующий объем вирус, который соответствует оптимальному МВД на клетки-мишени в каждую лунку. Если оптимальный МВД неизвестно, мы рекомендуем попробовать целый ряд различных Mois (например, МВД 1, 2 и 5 простых в инфицировать клетки культуры ткани и МВД 1, 10 и 20 для более трудных для заразить первичные клетки). Если концентрация частиц лентивирусов не известна (определяется на основе протокола titering вируса), различных объемов вируса можно попробовать, например, 1, 2 и 5 мкл вируса. Вирус может находиться в контакте с клетками-мишенями на срок до 72 часов.
5. Дальнейшие эксперименты с клетками-мишенями трансдуцированных интересов, может быть начато через 72 часа после трансдукции, когда вирусные конструкции интегрировался в геном клетки-хозяина. Изменение средних и прохождение клеток-мишеней интересов, в соответствии с их конкретными потребностями.

4. Представитель Результаты

Начальная плотность 293TN клеток имеет решающее значение для успешной вирусной упаковке. 293TN клетки должны быть от 60 до 80% сливной день трансфекции (рис. 2). Если 293TN клеток менее 60% вырожденная, дать им возможность расти в течение нескольких часов, прежде чем трансфекции. Если 293TN клеток> 80% вырожденная, то они должны быть replated до трансфекции.

При использовании lentivector выражения GFP, по крайней мере 90% 293TN клетки должны светиться зеленым через 24 часа после трансфекции, что указывает на успешное трансфекции (рис. 3). Если менее чем 90% клеток GFP-положительных, не переходите к следующему шагу, потому что это означает, что трансфекция не была успешной, и вирусные титры будет низкой. Вместо пластины нового 293TN клетки и начать заново, убедившись, что 293TN клетки на должном плотность клеток до трансфекции.

293TN клетки могут снять плиты культуре тканей 48-72 часов после трансфекции. Это не оказывает негативного воздействия производства лентивирусов частиц.

Titering с HT1080 клетки

Вирусные титры можно вычислить с помощью глобальной сверхбыстрой комплект ВОО Titering в соответствии с инструкциями производителя. Эта система использует КПЦР для измерения вирусной интеграции WPRE последовательность из лентивирусов вектора в клетки HT1080 и сравнивает их со стандартной кривой, на основе геномной последовательности ссылку, чтобы точно измерить инфекционных единиц на мл (рис. 4).

Трансдукция клеток-мишеней

При использовании лентивирусов частиц выразил конститутивно GFP маркер, GFP-положительных клеток должны начать появляться в течение 12-24 часов трансдукции, если трансдукции реакции работает. GFP выражение должно продолжаться после того, как конструкция лентивирусов стабильно интегрируется в тОн пройдет геном клетки. Если трансдукции с различными Mois, GFP флуоресценции должно примерно соответствовать МВД, где низкая Mois показать флуоресценции GFP меньше и выше Mois шоу увеличилось флуоресценция GFP (рис. 5).

Рисунок 1. Обзор вирусной Протокол производства. Lentivector и pPACK плазмиды упаковки смешиваются и совместно трансфекции в 293TN клеток. Через 48 -72 часов, вирусная супернатант собирали, и вирусные частицы осаждаются PEG-он. После titering лентивирусов частиц, они могут быть использованы для трансдукции клеток-мишеней, из интереса. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .

Рисунок 2. Фазового контраста изображения 293TN клеток. Сотовые DensitУ должна быть в пределах 60-80% сливной день трансфекции.

Рисунок 3. Флуоресцентное изображение GFP-положительных клеток 293TN 24 часов после трансфекции Purefection, pPACKH1 и lentivector кодирования конструкции GFP.

Рисунок 4. WPRE КПЦР результатов и стандартной кривой полученные с помощью глобальной сверхбыстрой комплект ВОО в Titering рассчитать МВД и соответствующим титром упакованных вирусных частиц.

Рисунок 5. Флуоресцентные изображения HT1080 клеток трансдуцированных с увеличением количества лентивирусов. Изображения с 72 часов после трансдукции.

Обсуждение

Это вирусное упаковки и трансдукции протокол клетки-мишени был оптимизирован для использования с вирусными реагентов ВОО на упаковке. Замена других реагентов может повлиять на исход протокола. Этот протокол был только оптимизирован для лентивирусов производства и не могут быть пригодны для производства других типов вирусов или pseudoviruses.

Успешные вирусные упаковки зависит от нескольких ключевых этапов. 293TN клетки экспрессируют SV40 большой Т-антиген, который является абсолютно необходимым для секреции лентивирусов частиц в супернатант культуры клеток. Плотность, при которой 293TN клетки во время трансфекции особенно важно для того, чтобы PureFection реагента достаточно передать lentivector и упаковка плазмиды в клетки. Добавление PureFection смесь на плиту культуры тканей в каплям образом следует тщательно закрученной пластины важно для разгона упаковке плазмидыlentivector и построить по всей клетки. Отсутствие надлежащего распространения векторов может привести к недостаточной лентивирусов частиц производится. Вирусной реакции упаковки могут быть расширены для производства высококачественных титра вируса, основанный на поверхность пластины тканевой культуры. Можно выбрать несколько пластин культуры тканей блюда 293TN клеток на конструкцию, которая должна быть упакована. Концентрация вирусной супернатантах особенно полезно при создании высоким титром вируса. Вирусный супернатант из нескольких пластин клетки могут быть объединены и сконцентрированы для использования в в естественных условиях эксперименты, или клетки, которые являются трудными для трансдукции.

Titering производится лентивирусов частиц важна для расчета точной МВД использовать для трансдукции клеток-мишеней. Зная, МВД, которая была использована в данном трансдукции позволяет устранения в том случае, трансдукция не увенчались успехом. Например, с помощью МВД, которыйслишком низком уровне может привести к очень мало клеток-мишеней выражает конструкция, из интереса. Использование МВД, что слишком высокая, однако, может привести к клеткам-мишеням, которые показывают признаки стресса. Цель заключается в использовании МВД, которая максимизирует выражение конструкция интересов, сохраняя здоровье клеток. Хотя мы рекомендуем КПЦР основе titering протокол, который измеряет интегрированных копий лентивирусов конструкцию в HT1080 клеток, другие подходы titering также может быть использован, например, p24 ELISA или оценка процентов GFP-положительных клеток.

Успешное трансдукции клеток-мишеней зависит также и от нескольких ключевых факторов. TransDux уникальный реагент инфекция, которая позволяет с высокой эффективностью трансдукции, но это не токсичен для клеток. TransDux могут быть использованы вместо polybrene, который часто токсичны для клеток-мишеней. Включение TransDux в трансдукции клеток-мишеней помогает нейтрализовать заряды на вирусные частицы и позволяет вируса в клеткус. С TransDux не токсичен для клеток, можно позволить лентивирусов частицы остаются в контакте с клетками в течение 72 часов (время, когда вирусные конструкции были интегрированы в геном клетки-хозяина), тем самым увеличивая вероятность того, что вирусных частиц, поступающих в клетку. Для некоторых трудных для трансдукции клеток, трансдукции может быть повторена в последующие дни, чтобы повысить эффективность трансдукции. Например, трансдукции клеток в 1 день, позволяют клеткам отдохнуть на 2-й день, а затем преобразовывать клетки снова на 3-й день. Важно, чтобы ждать 72 часов после последнего трансдукции перед началом отбора, дальнейшие эксперименты или характеристик клеток-мишеней.

Эффективность вирусной упаковке зависит также от размера лентивирусов конструкция, между 5 и 3'LTR регионах. В этом разделе лентивирусов конструкция должна быть около 9 кб или меньше, что соответствует размеру родной генома ВИЧ. Превышение 9 кб может де-увеличение титра производится pseudoviral частиц. Новые технологии, такие как piggyBac векторов транспозонов, позволяют надежной, стабильной интеграции трансгенов до 100 кб через один трансфекции. Такой подход может быть использован для конструкций, которые превышают предельный размер для лентивирусов векторов, в тех случаях, где это возможно для трансфекции клеток-мишеней, а также предоставляет дополнительное преимущество, не требующие вирусных шаг упаковке ^9,10.

Pseudoviral частиц, полученные с использованием этого протокола являются инфекционными, что они могут заразить большинство типов клеток млекопитающих. Продукты, используемые в настоящем протоколе, однако это третье поколение biosafe в том, что они производят, не репликативной и самостоятельно инактивируют pseudoviruses. Поэтому, как только преобразуются в клетки-мишени или животных, клетки-мишени или животных, не инфекционной или заразной. Замена других lentivector плазмиды, которые не являются третьего поколения biosafe возможно, хотя и не рекомендуется с биобезопасностьюперспективу. Вирусной Протокол производства и последующей трансдукции клеток-мишеней должно осуществляться под 2-го уровня биобезопасности, в соответствии с руководящими принципами NIH ^11, и исследователи должны всегда носить халат и перчатки при работе с вирусными частицами. Используется 293TN клеток производителя труб вирусных частиц, а также одноразовые пипетки следует выбрасывать в контейнер для биологически опасных соответствующий. Многоразовые пипетки и посуда должны быть обеззаражены с отбеливателем и автоклавирования для уменьшения облучения персонала.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Название реагента	Компания	Номер по каталогу	Комментарии
DMEM Высокий Средний Глюкоза	Гибко	11995-073
293TN клетки	ВОО	LV900A-1
pPACKH1	ВОО	LV500A-1	Для ВИЧ-инфекции на основе lentivectors
pPACKF1	ВОО	LV100A-1	Для FIV основе lentivectors
Любой вектор лентивирусов	ВОО	Различный	кДНК, ShRNA, микроРНК, журналисты транскрипции
PureFection	ВОО	LV750A-1 LV750A-5
PEG-он	ВОО	LV810A-1 LV825A-1
Глобальный сверхбыстрой комплект Titering	ВОО	LV961A-1	Не описана в этом протоколе, но необходимые для титровать вирусных частиц
TransDux	ВОО	LV850A-1