Стереотаксическая инъекция вируса для целенаправленного редактирования нейронных генов в мозге мыши

Аннотация

Источник: Fricano-Kugler, C. J., et al. Разработка, упаковка и поставка ретро и лентивирусов CRISPR с высоким титром путем стереотаксического впрыска. J. Vis. Exp. (2016)

В этом видео демонстрируется стереотаксическая инъекция вируса для точного редактирования нейронных генов в мозге мыши. Протокол обеспечивает точную доставку вируса в зубчатую извилину, позволяя проводить флуоресцентное мечение и CRISPR-опосредованную нокаут генов для изучения нейронных цепей, функции генов и механизмов заболевания in vivo.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными моделями, были рассмотрены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным советом JoVE.

1. Стереотаксическая инъекция

1. Убедитесь, что вентиляция в операционном отделении открыта для обеспечения надлежащего потока воздуха. Подготовьте мышь к операции, обезболив ее 4% изофлураном в индукционной камере. После анестезии побрейте голову, чтобы подготовить место инъекции.
   1. Поместите мышь в стереотаксический инструмент, используя пинцет, чтобы переместить язык вниз и в сторону. Вставьте прикусную планку в рот до тех пор, пока зубы не опустятся в прорезь, затем закрепите ушные планки. Убедитесь, что корпус мыши находится на грелке, а носик расположен в носовом конусе. Направьте 4% изофлуран в носовой конус. Подтвердите анестезию, зажав ногу пинцетом и убедившись в отсутствии рефлекса испуга.
   2. Нанесите искусственные слезы для смазки глаз. Завершите подготовку места инъекции, протирая бритую голову чередующимися раундами повидон-йода и лидокаина.
2. С помощью скальпеля сделайте небольшой надрез по центру кожи головы. Высушите череп тампоном и перекисью водорода, если это необходимо, чтобы помочь визуализировать брегму.
   1. Используя препарирующий эндоскоп, найдите брегму на черепе и поместите наконечник сверла на брегму. Обнулите (или запишите) цифровые стереотаксические координаты в плоскостях x, y и z.
   2. Чтобы убедиться, что головка находится на одном уровне по ростральной и каудальной оси y, поместите сверло на лямбду и выровняйте головку так, чтобы z-координата была примерно одинаковой как в брегме, так и в лямбде.
   3. Для того, чтобы головка находилась на уровне оси x, установите сверло в точке y = 1/2 лямбда. Убедитесь, что z-координата равна 1 мм с каждой стороны (x = +/-1 мм) сагиттального шва. Отрегулируйте череп, если есть разница в z-координате на 1 мм слева и справа от лямбды.
3. Поместите сверло по нужным координатам. Для зубчатой извилины используйте координаты y = -1.9 из брегмы и x = +/- 1.1. Перед сверлением опустите изофлуран до 2%, затем медленно и осторожно просверлите череп.
   1. Просверлив все отверстия, прикрепите наполненный шприц к стереотаксическому инструменту. Визуально центрируйте шприц над отверстием и обнулите координату z на черепе.
   2. Медленно опустите шприц на самую глубокую z-глубину. Для зубчатой извилины глубина z составляет -2,5, -2,4 и -2,3. Начните впрыск со скоростью 0,25 мкл/мин с помощью стереотаксического инжектора.
      1. После завершения внедрения на самой низкой Z-глубине, подождите 1 минуту, затем поднимите до следующей координаты и начните внедрение снова. Продолжайте использовать этот шаблон до тех пор, пока не будут введены все координаты z-инъекции. Подождите 2 минуты, прежде чем извлекать шприц после последней инъекции.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Не было отмечено никаких побочных эффектов на ткани при введении до 2 μл вируса на каждое полушарие в мозг мыши.
   3. Повторите закачку для других скважин.
4. После инъекции снимите мышь со стереотаксического инструмента и зашите кожу головы шелковыми швами 6-0. Нанесите на рану лидокаин и антибактериальный крем.
   1. Введите 0,8-1,0 мл физраствора + кетопрофен (3-5 мг/кг) внутрибрюшинным путем (ВВ) для снятия боли. Затем поместите мышь в нагретую камеру восстановления. Не оставляйте животное без присмотра до тех пор, пока оно не придет в сознание, достаточное для поддержания лежачего положения на грудине. Не возвращайте животное в компанию других животных до тех пор, пока оно полностью не выздоровеет.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Stereotaxic Surgery Reagents
Vet-Syringe vet use T.B. Шприц только 1cc luer slip T.B. 100/bx	Med-Vet International	1CCVLS
Isoflurane
Лезвия скальпеля из нержавеющей стали, #10, 100-шт.	Med-Vet International	JOR580S
Искусственная мазь	Med-Vet International	RXPARALUBE-O
PVP PrepSolution	Med-Vet International	HPIV108208H
Нормальный физиологический раствор	Med-Vet International	DYND500MLSH
Аппликаторы с ватными наконечниками	Med-Vet International	CTA6
Тройная мазь с антибиотиком	Med-Vet International	RXTRIP-OI15
MONOJECT® Иглы Soft Pack 25г x 5/8"	Med-Vet International	25058
6-0 шелковые шовные материалы	Med-Vet International	MV-711