Нейротерапевтическая доставка лекарств на основе осмотической помпы в демиелинированной мышиной модели

Аннотация

Источник: Wang, X. et al., Osmotic Pump-based Drug-delivery for in vivo Remyelination Research on the Central Nerve System. J. Vis. Exp. (2021)

В этом видео демонстрируется метод доставки нейротерапевтических препаратов с помощью осмотического насоса в демиелинизированной мышиной модели. Контролируемое высвобождение препарата способствует ремиелинизации путем активации миелин-продуцирующих клеток в мозолистом теле.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными моделями, были рассмотрены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным советом JoVE.

1. Создание модели мышиного демиелинизации, индуцированного лизолецитином

1. : Приготовьте 1% раствор лизолецитина (также называемого L-α-лизофосфатидилхолином) со стерильным фосфат-буферным физиологическим раствором (PBS).
2. Стерилизуйте ножницы, щипцы, изогнутые гемостатики и другие хирургические инструменты методом автоклавной стерилизации. Простерилизуйте операционную область и уложите стерильные листы. Все материалы и реагенты, используемые для операции, должны быть подготовлены асептично. Важно, чтобы операционная область оставалась стерильной на протяжении всей процедуры.
3. Обезболите мышь на 56-й день после рождения (P56) C57BL6 следующим образом.
   1. Поместите мышь в изофлурановую камеру аппарата для анестезии мелких животных. Отрегулируйте расход_О2 до 300-500 мл/мин и изофлурана до 3%-4%. После достаточного обезболивания, когда мышь становится неподвижной с медленным и устойчивым дыханием, переведите мышь в стереотаксический аппарат с грелкой.
   2. Переключите выход газа из камеры на маску для анестезии и отрегулируйте изофлуран до 1%-1,5%, чтобы поддерживать мышь в состоянии анестезии. Подождите, пока мышь полностью обезболится, затем введите кетопрофен (3–5 мг/кг) внутрибрюшинно, чтобы облегчить боль. Перед операцией ущипните пальцы ног мыши и проверьте ее реакцию, чтобы подтвердить успешное обезболивание.
   3. Когда мышь находится под наркозом, она не может регулировать температуру своего тела. Поэтому контролируйте и регулируйте температуру тела мыши во время операции. Покройте поверхность глазных яблок мыши глазной мазью с эритромицином, чтобы глазные яблоки оставались влажными во время анестезии.
4. Закрепите головку мыши в стереотаксическом аппарате с помощью зубчатого стержня и ушных планок. (Рисунок 1А).
5. Используйте бритву, чтобы удалить волосы с макушки. Продезинфицируйте кожу головы с помощью трех циклов бетадина и 75% этанола. По этическим соображениям накрывайте тело животного, за исключением места операции. С помощью скальпеля сделайте среднесагиттальный разрез кожи длиной 1 см от основания шеи до промежутка глаз, чтобы обнажить череп (рисунок 1B).
6. Аккуратно протрите поверхность черепа стерильным ватным тампоном, содержащим 30% перекиси водорода, чтобы визуализировать черепные швы (рисунок 1C). Отрегулируйте высоту зубчатого стержня и ушных стержней, чтобы точка лямбда и точка брегмы располагались на одной высоте (т. е. с одинаковыми координатами оси Z, когда кончик иглы касается точек), чтобы сагиттальный шов был горизонтальным.
7. Аккуратно поместите кончик микролитровой иглы шприца (10 μL, 33 G) в точку брегмы и установите координаты x, y и z на 0 (рисунок 1D). Переместите шприц к месту инъекции (x: 1,04; y: 1,0, т. е. на 1,04 мм латерально к средней линии и на 1,0 мм позади точки брегмы) в соответствии с подсказкой цифрового считывания (рис. 1E).
8. Медленно просверлите небольшое отверстие в черепе в месте инъекции, не проникая в твердую мозговую оболочку, иглой шприца объемом 1 мл (26 G, 0,45 мм) (рис. 1F). Медленно вводите микролитровую иглу шприца в ткань мозга через отверстие до тех пор, пока не будет достигнута определенная глубина (z = -1,62 мм для большинства мышей P56) (Рисунок 1G).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эмпирически установлено, что глубина введения -1,62 мм позволяет кончику иглы достичь середины мозолистого тела у большинства мышей P56, чтобы лизолецитин мог быть непосредственно доставлен в мозолистое тело для индуцирования демиелинизации.
9. Введите 1,5 мкл 1% лизолецитина со скоростью 0,3 мкл/мин. После инъекции подождите 5 минут, прежде чем медленно вытащить микролитровый шприц, чтобы предотвратить утечку жидкости по траектории инъекционной иглы.
10. Наложите на кожу хирургические швы 5-0 (Рисунок 1H).
11. Поместите мышь на грелку, чтобы избежать падения температуры тела. Вводите подкожную инъекцию 5 мг/кг карпрофена каждые 24 часа для облегчения боли. Наносите эритромициновую мазь на разрез каждый день, чтобы убедиться, что рана заживает должным образом. Поместите мышь, перенесшую операцию, в клетку одну и кормите ее влажным кормом до полного выздоровления. Следите за мышью ежедневно после операции.

2. Подготовка осмотического насоса

ПРИМЕЧАНИЕ: Основные компоненты насоса показаны на рисунке 2A.

1. Определите глубину введения канюли для инфузии мозга в головной мозг. Убедитесь, что длина иглы используемой канюли для инфузии мозга составляет 3 мм, а каждый спейсер для регулировки глубины — 0,5 мм. Чтобы добиться глубины инъекции 1,5 мм (близко к мозолистой), прикрепите три прокладки для регулировки глубины к игле канюли для инфузии мозга с помощью тканевого клея (рис. 2B, C).
2. Чтобы наполнить осмотическую помпу, прикрепите иглу шприца, которая идет в комплекте с помпой, к шприцу объемом 1 мл и аспирируйте препарат. Держите помпу вертикально, вставьте шприц в отверстие в верхней части помпы и медленно вводите препарат, стараясь не создавать пузырьков (см. рисунок 2D). Когда жидкость вытечет из отверстия, медленно вытащите шприц.
3. Снимите белый фланец с регулятора потока ножницами или плоскогубцами, стараясь не согнуть и не раздавить замедлитель потока. Затем вставьте замедлитель потока в насос (рис. 2E). Чтобы определить, есть ли пузырьки в осмотическом насосе, взвесьте осмотический насос отдельно до и после наполнения.
4. Обрежьте катетер до определенной длины в соответствии с размерами животного (катетеры 20-25 мм для мышей P56, которые весят около 25 г). Прикрепите катетер к канюле для инфузии мозга.
5. Заполните катетер лекарственными препаратами с помощью шприца без введения воздуха (рисунок 2F).
6. Подсоедините катетер к замедлителю потока. После установки убедитесь, что катетер покрывает примерно 4 мм от открытого замедлителя потока (рисунок 2G).
7. Чтобы убедиться, что осмотический насос может работать мгновенно после имплантации, погрузите заполненные насосы в стерильный 0,9% физиологический раствор или PBS при температуре 37 °C на срок не менее 4–6 часов (предпочтительно продлить на ночь) для предварительного увлажнения полупроницаемой мембраны на поверхности насоса растворами, которые имеют такое же осмотическое давление, как и тканевая среда (рисунок 2H).
8. Все растворы, загруженные в насосы, должны быть стерильными. Насосы ALZET поставляются стерильными, подвергшись воздействию стерилизующей дозы кобальта-60. Однако при возникновении внешнего загрязнения поверхность насоса можно очистить, протерев ее изопропиловым спиртом (70% в воде).

3. Имплантация осмотической помпы

1. : Подождите 3 дня после создания модели демиелинизации мозолистого тела. Включите систему анестезии для мелких животных. Продезинфицируйте ножницы, пинцет и кровогубцы и замочите их в 75% спиртовом растворе. Уложите стерильные листы в операционную зону.
2. Обезболите и закрепите мышей на стереотаксическом аппарате еще раз. Покройте поверхность глазных яблок глазной мазью, чтобы предотвратить сухость.
3. Продезинфицируйте исходную рану 75% спиртом. Откройте хирургический разрез, который был ранее зашит (рисунок 3A), и расширьте разрез до лопаток (рисунок 3B).
4. Отделите кожу от подкожной соединительной ткани с помощью кровоостанавливающих плоскогубцев или пинцета у лопатки, чтобы открыть полость (рисунок 3В). Поместите осмотический насос в полость (Рисунок 3D, E).
5. Ватным тампоном аккуратно протрите и обнажите отверстие на поверхности черепа, образовавшееся при установлении модели демиелинизации (см. шаг 1.8). Вставьте канюлю для инфузии мозга через это отверстие перпендикулярно и быстро закрепите его на черепе с помощью тканевого клея (рис. 3F).
6. Снимите съемный язычок над канюлей для инфузии мозга с помощью ножниц (рисунок 3G, H). В качестве альтернативы сначала снимите язычок перед вставлением канюли, чтобы избежать тряски во время этого процесса.
7. Зашейте разрез или прикрепите его тканевым клеем (рисунок 3I).
8. После операции поместите мышь на грелку, чтобы избежать падения температуры тела. Вводите подкожную инъекцию 5 мг/кг карпрофена каждые 24 часа для облегчения боли. Наносите эритромициновую мазь на разрез каждый день, чтобы убедиться, что рана заживает должным образом. Поместите животное в клетку одного и кормите его влажной пищей до полного выздоровления.

Результаты

Рисунок 1: Создание модели мыши, вызванной демиелинизацией, вызванной лизолецитином. (A) Закрепите мышь в стереотаксическом аппарате. (B) Откройте средний сагиттальный разрез на 1 см, чтобы обнажить череп. (В

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Дыхательный воздушный насос	RWD	R510-29	E05818-006
Набор для инфузии мозга 3	ALZET	8851	1-3 мм
Карпрофен	Маклин	C830557-1 г	5 мг/кг каждые 24 часа
Эритромицин глаз мазь	Along technology	YCKJ-RJ-024780	Покрыть поверхность глазных яблок во время анестезии
Эритромициновая мазь	pythonbio	RG180
Аппарат для эвакуации газа	RWD	R546W	E05518-002
L-α-лизофафотидилхолин	Sigma	L0906	Растворить на 1% с помощью стерильного PBS
Микролитровый шприц	Hamilton	65460-05	Серия шприцев:1700, 10 μл, 33 калибр
Микроосмотический насос модель 1002	ALZET	4317	0,25 μл в час, 14 дней
PBS (pH = 7,3)	ORIGENE	ZLI-9061
Пентобарбитал натрия	Shanghai Civi	CAS NO: 57-33-0	150-200 мг/кг внутрибрюшинная инъекция для эвтаназии
Аппарат для анестезии мелких животных	RWD	R520IE	E05807-006 M
Стереотаксическое оборудование	RWD	E06382
STERI 250 стерилизатор	Keller	31101	Быстрая стерилизация хирургических инструментов
Хирургические шовные материалы	Shanghai jinhuan	F504	5-0
Игла для шприца (1 мл)	Shanghai KDL	6930197811018	26 калибр (0,45 мм x 16 мм)
Тестирование препарата и растворителя	Зависимый от эксперимента	Н/Д
Гомеотермическая система мониторинга Thermostar	RWD	69026	Поддержание температуры тела во время анестезии
Тканевый клей Vetbond	3M	1469SB	Закрепите канюлю для инфузии мозга и приклейте разрез кожи