Интратекальная доставка исследуемого соединения в центральную нервную систему крысы

Аннотация

Источник: Chen, Y., et al. Интратекальная доставка антисмысловых олигонуклеотидов в центральную нервную систему крысы. J. Vis. Exp. (2019)

В этом видео демонстрируется доставка тестового соединения в спинномозговую жидкость (ликвор) через катетер, имплантированный в поясничный отдел позвоночника модели крысы. Соединение циркулирует по спинномозговой жидкости к головному и спинному мозгу, проникает в нейроны и обладает терапевтическим потенциалом.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными моделями, были рассмотрены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным советом JoVE.

1. Хирургическое вмешательство

1. С помощью крысы, поддерживаемой конической трубкой объемом 50 мл, определите две естественные ямки между мышцами над тазом (стрелки на рисунке 1A). Держа одной рукой эти ямки, другой рукой осторожно надавите и прощупайте позвоночник от каудального до рострального направления и найдите первое крупное углубление между позвонками, а это межпозвоночное пространство между крестцовыми позвонками 1 (S1) и поясничным 6 (L6) позвонками (рис. 1B).
2. Слегка сдвиньтесь рострально, чтобы определить следующее углубление, межпозвонковое пространство между поясничными позвонками 5 (L5) и L6, а также место инъекции (* на рисунке 1A). С помощью скальпеля сделайте разрез длиной не более 2 см на коже по средней линии от ростральной до каудальной так, чтобы место инъекции находилось в центре разреза (пунктирная линия на рисунке 1А).
3. Используйте ножницы для пресечения, чтобы рассечь соединительную ткань, чтобы визуализировать мышечный слой. Затем сделайте разрез на 1 см в мышечной капсуле непосредственно латерально от дорсального спинномозгового отростка поясничного позвонка L6.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Кости поясничного позвонка L6 могут быть визуализированы в этой точке.
4. Расположите узел направляющей канюли-иглы рядом с передней стороной 6-го поясничного позвонка и протолкните его в межпозвонковое пространство вдоль передней части 6-го позвонка так, чтобы конец иглы проникал в спинномозговой канал. Протолкните направляющую канюлю на место вдоль иглы и извлеките иглу 23-G, оставив на месте только направляющую канюлю.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Перед введением иглы полезно использовать тупые щипцы для определения местоположения дорсального отростка поясничного позвонка L6. Как правило, можно увидеть, как жидкость спинномозговой жидкости (ликвор) попадает в ступицу иглы (эта жидкость может иметь оттенок крови, но это не указывает на нанесение вреда или неправильное размещение иглы). Авторы не наблюдали большого количества крови или сильного кровотечения во время этой процедуры. В любом случае следует связаться с ветеринаром, чтобы определить подходящее лечение и следует ли усыплять животных.
5. Вставьте катетер-проволоку в сборе в направляющую канюлю. Наклоните катетер-проволоку вниз под углом примерно 45° к позвоночному каналу и с силой переместите конец примерно на 0,3 см в спинномозговой канал.
6. Извлеките направляющую канюлю, оставив на месте катетер со стилетной проволокой. Удалите стилетную проволоку примерно на 2,5 см от интратекального кончика катетера и продвигайте катетер в спинномозговой канал до тех пор, пока отметка 2 см не окажется у входа в канал (только видимая ниже мышцы), как показано на рисунке 2Bvi.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Введенный катетер должен расширяться рострально в субарахноидальное пространство. Успешная установка должна позволить катетеру свободно перемещаться в этом пространстве.
7. Полностью извлеките стилетную проволоку, и можно увидеть, как спинномозговая жидкость входит в имплантированный катетер.
8. Подсоедините узел приемного катетера к дистальному концу имплантированного катетера с помощью наконечника иглы 30 G (рис. 2Bv, vi).
9. Загрузите 60 мкл стерильного физиологического раствора в шприц объемом 100 мкл (промывочный шприц). Загрузите болюс 30 мкл исследуемого соединения (например, антисмыслового олигонуклеотида или раствора АСО) во второй шприц (шприц для инъекций).
10. Подсоедините промывочный шприц (наполненный физиологическим раствором) к концу адаптера трубки узла приемного катетера (рисунок 2Bv). Введите 20 мкл стерильного физиологического раствора во внутрибольничное пространство (предварительное промывание).
11. Подсоедините инъекционный шприц (заряженный тестируемым составом) к концу адаптера трубки узла приемного катетера (Рисунок 2Bv). Введите 30 μL испытуемого соединения в интратекальное пространство в течение 30 с.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рутинный объем инъекции ASO составляет 30 μL для достижения хорошего нокдауна в спинном мозге и в коре головного мозга. Сообщалось, что объемы впрыскиваемых углекислых углей могут влиять на распределение соединений, хотя различные объемы впрыска не тестировались. Если используется другое соединение или объем, безопасность и эффективность должны быть определены эмпирически.
12. Повторите шаг 1.10 и промойте катетер еще 40 мкл стерильного физиологического раствора (промывание после инъекции). Затем отсоедините узел приемного катетера от имплантированного катетера.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Считается, что промывка до и после инъекции уменьшает локальную секвестрацию соединений и улучшает их распределение по ростральным структурам.
13. Чтобы асептически разрезать и запечатать имплантированный катетер, поместите пару стерильных щипцов для рассечения в стерилизатор шариков, пока они не станут очень горячими, затем зажмите трубку горячим концом щипцов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это действие расплавляет катетер. Таким образом, отверстие в трубке разрушается, и все стороны прилипают друг к другу, герметизируя трубку асептическим образом. Затем его помещают в подкожное пространство.
14. Используйте рассасывающиеся монофиламентные нити, чтобы закрепить оставшийся термосваренный катетер к соединительной ткани. Затем используйте нерассасывающиеся монофиламентные швы, чтобы закрыть кожу над защищенным термосваренным катетером.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Раневые зажимы также можно использовать в соответствии с протоколом Комитета по уходу и использованию животных (IACUC). Эта техника совместима с повторными инъекциями, хотя она использовалась только для одноразовых инъекций в наших руках. Целесообразность повторных инъекций должна быть эмпирически оценена с одобрения IACUC.
15. Используйте марлю и физиологический раствор, чтобы смыть кровь с кожи и дать животному восстановиться после анестезии в отапливаемом инкубаторе до тех пор, пока оно не станет подвижным, после чего его возвращают в домашнюю клетку (по две крысы в клетке).
    ПРИМЕЧАНИЕ: При проведении операций на нескольких крысах в один и тот же день очистите инструменты водой для удаления крови и повторно простерилизуйте с помощью нагретого стерилизатора сухих шариков (в течение не менее 20 с, со временем остывания) между животными. На каждые 5 животных используется новый набор инструментов.
16. Наблюдайте за животными ежедневно в течение как минимум 3 дней после операции и продолжайте наблюдать за ними еженедельно после операции, в соответствии с протоколом IACUC.

Результаты

Рисунок 1: Идентификация места инъекции и линии разреза. (А) Когда брюшная полость крысы поддерживается конической трубкой объемом 50 мл, две ямки между мышцами над тазом легко видны (стрелки). (В) Одной рукой, держа подмышки, другой рукой осторожно нада...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
BD intramedic полиэтиленовая трубка	BD	Полиэтиленовая трубка PE50, диаметр 0,023 in	BD 427400 (10 футов, Fischer Scientific 22-204008) или 427401 (100 футов, Fischer Scientific 14-170-12P)
BD intramedic полиэтиленовая трубка	BD	Полиэтиленовая трубка PE10, диаметр 0,011 в	BD 427410 (10 футов, Fischer Scientific 14-170-11B) или 4274011 (100 футов, Fischer Scientific 14-170-12B)
BD PrecisionGlide одноразовые иглы 30G	BD BD
Направляющая канюля	BD	19G x 1 WT (1,1 мм x 25 мм) игла	BD 305186
шприц Hamilton 100 мкл	Hamilton company	Hamilton шприц 100 мкл
Стерилизатор горячих шариков	Fine Science Tools		Стерилизатор модель No FST 250
Повидоновый скраб	PDI		S48050
Физиологический раствор	Baxter	Хлорид натрия 0,9% внутривенная инфузия BP 50 мл	FE1306G
Скальпель	Перо	Одноразовый скальпель	No 10
Грелка для мелких животных	K&H Производство		Модель No 1060
Стилетная проволока	McMaster-Carr	1749T14	LH-36233780
Хирургическое полотенце простыня	Dynarex		4410
Хирургические ножницы и щипцы	FST и швы Fisher Scientific
	Ethicon		4-0 или 5-0
Альтернативный источник готовых и стерилизованных материалов для данной процедуры
Дозирующий катетер система	SAI Инфузионные системы		RIDC-01
Направляющая канюля	SAI Инфузионные системы		RIDC-GCA
Внутренние катетеры	SAI Инфузионные системы		RIDC-INC
Стилетная проволока	SAI Инфузионные системы		RIDC-STY

305128