Оценка лечения атмосферным давлением плазмы в клетках нейробластомы, лишенных глюкозы

Аннотация

Источник: Yan, X., et al., Новое применение струи плазмы атмосферного давления в качестве нейропротекторного агента против индуцированного депривацией глюкозы повреждения клеток SH-SY5Y. J. Vis. Exp. (2017)

В видеоролике показана нейропротекторная активность лечения низкими дозами атмосферного давления в клетках нейробластомы, лишенных глюкозы, путем модуляции окислительного стресса и повышения жизнеспособности клеток.

Протокол

1. APPJ (плазменная струя атмосферного давления) обработка SH-SY5Y

1. Отрегулируйте расстояние между соплом кварцевой трубки и платформой, на которой будет размещена 96-луночная пластина, с точностью до 3 см. Убедитесь, что луч может касаться поверхности питательной среды.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Расстояние не измеряется от нижней части пластины. Сначала он регулируется на расстоянии 3 см между соплом кварцевой трубки и платформой, используемой для размещения 96-луночной пластины.
2. Перед обработкой плазменной струей атмосферного давления (APPJ) измените питательную среду в каждой лунке, за исключением контрольных лунок, на RPMI 1640 без глюкозной среды.
3. Поместите пластину под сопло APPJ и убедитесь, что струи могут выстреливать вертикально в каждую скважину.
4. Обрабатывайте клетки в отдельных лунках APPJ в течение 0 с, 1 с, 2 с, 4 с, 8 с и 12 с.<бр />ПРИМЕЧАНИЕ: APPJ образуется путем ионизации гелия (Рисунок 1). Клетки, поврежденные в результате депривации глюкозы, обрабатываются потоком гелия в течение 4 с и 8 с для устранения воздействия гелия на клетки. Все процедуры должны проводиться в трех экземплярах.

2. Анализ жизнеспособности клеток

ПРИМЕЧАНИЕ: Не меняйте среду на этом этапе.

1. После лечения APPJ инкубируйте клетки в течение 1 ч в клеточном инкубаторе.
2. Добавьте в каждую лунку по 10 мкл раствора Cell Counting Kit-8 (CCK-8).
3. Инкубируйте клетки при 37 °C в течение 4 ч<бр />ПРИМЕЧАНИЕ: Клеточная линия SH-SY5Y чувствительна к условиям депривации глюкозы. Жизнеспособность клеток снижается почти до 50% после 1 ч депривации глюкозы, что является оптимальным условием жизнеспособности клеток для исследований фармакодинамики. CCK-8 не обладает цитотоксичностью для клеток, и клетки инкубируют с реагентом CCK-8 в течение еще 4 ч в условиях депривации глюкозы после лечения APPJ для проверки жизнеспособности клеток. После 8 ч депривации глюкозы и лечения APPJ защитный эффект APPJ был значительно снижен, поскольку длительная продолжительность депривации глюкозы приводила к серьезному повреждению клеток SH-SY5Y. Не было никаких признаков наличия живых клеток после 24 ч депривации глюкозы.
4. Измерьте поглощение на длине волны 450 нм с помощью считывателя микропланшетов.

Результаты

Рисунок 1: Типичные реакции RNS (реактивные формы азота) и ROS (активные формы кислорода) в излучении APPJ (плазменная струя атмосферного давления).

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
SH-SY5Y клеточная линия Китайский	центр коллекции типовых культур	3111C0001CCC000026
RPMI 1640 среда	Thermo Scientific	21875091	Хранится при 4 °C
RPMI 1640 среда без глюкозы	Термо Scientific	11879020	Хранится при 4 °C
Сыворотка теленка	плода Thermo Scientific	16000044	Хранится при -20 °C
96 лунок планшет	corning	3599
Набор для подсчета клеток-8 (CCK-8)	Dojindo Laboratories	CK04	Хранится при 4 °C
Считыватель микропланшетов	Tecan	M200 Pro	Для измерения абсорбции при 450 нм
Высоковольтный усилитель мощности	Trek	PD06087	Для усиления мощности
Функциональный генератор сигналов	MaZe Electronics Science&Technology	AT30120	Для подачи специфического сигнала
Высоковольтный пробник	Tektronix	P6015A	Для детектирования высоковольтного
цифрового осциллографа	Tektronix	DPO4104B	Для отображения сигнала