Интраназальная доставка миРНК в мозг мыши с помощью позиционирующего устройства

Аннотация

Источник: Ullah, I., et.al. Позиционирующее устройство для размещения мышей во время интраназальной доставки миРНК в центральную нервную систему. J. Vis. Exp. (2019)

В этом видео демонстрируется точная техника интраназального введения для доставки комплексов пептид-миРНК, нацеленных на нейроны, в мозг мыши с помощью специализированного устройства позиционирования. Мышей под наркозом фиксируют в положении головой вниз и вперед, чтобы оптимизировать вдыхание миРНК и предотвратить дренирование легких. Целевой пептид способствует опосредованному рецепторами поглощению в нейронах, обеспечивая целевую доставку миРНК и подавление экспрессии генов в мозге.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными моделями, были рассмотрены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным советом JoVE.

1. Позиционирование мыши

1. Оценивайте уровень анестезии с помощью педального рефлекса (твердого защемления пальца ноги) для поддержания операционной плоскости.

2. Разместите позиционирующее устройство на соответствующем расстоянии и высоте, чтобы обеспечить удобный доступ ко всем необходимым реагентам.

3. Как только мыши будут должным образом обезболены, осторожно поднимите каждую мышь за загривок большим и указательным пальцами и положите ее на указанный стул.

4. Правильное расположение мыши на стуле очень важно на этом этапе. Положите спинку мыши параллельно опоре спинки кресла и под углом 90° к сиденью кресла. Уберите руки с мыши и дайте животному естественно лечь в положение головой вниз и вперед, не толкая и не надавливая, как показано на рисунке 1B. Убедитесь, что передние конечности мыши обеспечивают естественную поддержку, пока животное находится в этом расслабленном положении, без какого-либо дискомфорта для мыши.

5. Как только мыши правильно расположитесь, пристегните мышей ремнем стула и немедленно начните интраназальную инокуляцию.

2. Интраназальная (IN) доставка

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол описывает доставку IN комплексов RVG9R:siRNA с помощью устройства позиционирования мыши. Используя этот протокол, можно легко ввести максимум 20-30 мкл раствора каждой мыши в каплях по 2 мкл. Этот объем ниже, чем у носовой полости мыши, которая составляет 0,032 см³ , поэтому процедура не приводит к смертельной непроходимости ноздрей или удушью. Этот протокол позволяет одновременно прививать не менее четырех мышей и максимум восемь мышей на устройство, что приводит к оптимизации времени и снижению вариативности.

1. Возьмите микропипетку объемом 10 мкл и отрегулируйте ее до 2 мкл.

2. Загрузите в микропипетку 2 мкл комплексного раствора RVG9R:siRNA (например, 5,2 мкг siCy5 в комплексе с 104 мкг RVG9R для эксперимента по доставке и 13,5 мкг siSOD1 в комплексе с 270 мкг RVG9R для эксперимента по подавлению, в конечном объеме 25 мкл PBS, содержащего 5% глюкозы.

3. Держа пипетку в доминирующей руке, отрегулируйте положение, положив локоть на столешницу. Поддерживайте руку, держащую пипетку, другой рукой, чтобы избежать неконтролируемых движений во время введения.

4. Поместите каплю ~2 μL очень близко к одной ноздре, чтобы мышь могла напрямую вдохнуть каплю (см. Рисунок 1B). Если крошечная капля образуется нелегко, то замените наконечник пипетки на новый и повторите операцию. Используйте секундомер, чтобы проверить временной интервал между прививками.

5. Это устройство позволяет лечить как минимум четырех мышей одновременно. Если требуется повторить шаг 2.4 для другой группы мышей, установите еще одну планку с четырьмя стульями выше или ниже первой планки с четырьмя стульями, чтобы одновременно разместить на устройстве до восьми мышей.

6. Повторите шаг 2.4 с другой ноздрей через 3-4 минуты после первой прививки. Этот временной интервал достаточен для того, чтобы мышь завершила ингаляцию первой дозы и восстановила нормальное дыхание. Если капля ингаляционного раствора выбивается из-за случайного вдыхания из ноздрей мыши, повторно введите еще 2 мкл раствора.

7. Повторяйте весь процесс с чередующимися ноздрями, пока не закончится доза 20-30 μL. Для завершения всей процедуры инокуляции потребуется ~30-45 минут.

8. Нанесите влажную мазь на глаза мышей, прежде чем возвращать мышей обратно в предназначенные для этого клетки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не оставляйте мышей без присмотра, пока они не придут в сознание, достаточное для поддержания лежачего положения на грудине.

Результаты

Рисунок 1: Фотографическое представление процедуры инокуляции IN с использованием позиционирующего устройства. (А) Экспериментальное оборудование, необходимое для инокуляции ИН. (B) Животные в положении головы вниз и вперед, сидящие на устройств...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Мышиный штамм
Balb/c	Orient Bio	N/A	6-8-недельной выдержки, 20-30г
пептидов
RVG9R	Peptron	N/A	YTIWMPENPRPGTPCDIFTNSR GKRASNGGGGRRRRRRRRRRR
RVM9R	Peptron	N/A	MNLLRKIVKNRRDEDTQKSS PASAPLDGGGGRRRRRRRRR
Программное обеспечение, алгоритмы и устройства
Устройство для позиционирования мыши	Signet Biotech	N/A
Олигонуклеотиды и праймеры
siSOD1	ST Pharm	N/A	Смысл: 5'- GGUGGAAAUGAAGAAAGUA-3'SOD1
праймеры	ST Pharm	Н/Д	F: 5'-CCAGTGCAGGACCTCATTTT-3' R: 5'-CACCTTTGCCCAAGTCATCT-3'