Выделение и очистка рекомбинантных гликопротеинов миелина олигодендроцитов

Аннотация

Источник: Jain, R. W., et al. Простое и эффективное производство и очистка гликопротеина миелина олигодендроцитов мышей для экспериментальных исследований аутоиммунного энцефаломиелита. J. Vis. Exp. (2016)

В этом видео показано выделение и очистка MOGtag, рекомбинантного гликопротеина миелина олигодендроцитов (MOG), используемого в экспериментальных исследованиях аутоиммунного энцефаломиелита (EAE). Протокол включает в себя бактериальный лизис, ультразвуковую обработку, центрифугирование и аффинную хроматографию никеля для получения очищенного MOGtag. Этот белок позволяет проводить исследования В-клеточного аутоиммунитета на моделях рассеянного склероза.

Протокол

1. Сбор белка MOGtag

ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе бактерии произведут большое количество белка MOGtag. Чтобы собрать MOGtag, бактерии сначала лизируют в буфере Triton X-100, а затем проводят ультразвуковую обработку. Затем MOGtag высвобождают из тел включения и денатурируют имидазолом и гуанидином, в результате чего получается раствор сырого белка, содержащий белок MOGtag.

1. Возьмите одну аликвоту 1 мл из одной из ночных культур и переложите ее в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл. Гранулируйте клетки при 16 000 x g в течение 1 минуты и удалите надосадочную жидкость. Пометьте пробирку TO/N (после индукции), затем поместите бактериальную гранулу в морозильную камеру при температуре -20 °C для последующего анализа страницы паспорта безопасности (Рисунок 2).
2. Равномерно распределите культуры по бутылкам объемом 250 мл, совместимым с высокоскоростным центрифугированием, и держите их на льду с этого момента. Гранулируйте бактериальные клетки при концентрации 22 000 x g в течение 15 минут при температуре 4 °C.
3. Выбросьте надосадочную жидкость. Храните бактериальные гранулы при температуре -20 °C или перейдите к шагу 1.4.
4. Приготовьте буфер для лизиса (0,1 мг/мл лизоцима куриного яйца, 0,1% Triton-X (v/v) в фосфатно-солевом буфере (PBS)) путем добавления 60 мкл Triton X-100 и 120 мкл 50 мг/мл исходного раствора лизоцима куриного яйца к 60 мл PBS.
5. Повторно суспендируйте и смешайте все бактериальные гранулы, полученные на шаге 1.3, в общей сложности 30 мл буфера для лизиса. Перенесите этот объем в пробирку с круглым дном объемом 50 мл, способную проводить высокоскоростное центрифугирование. Поместите эту трубку на водяную баню при температуре 30 °C на 30 минут. Во время инкубации дважды встряхните трубку, чтобы вернуть клетки на суспендию.
6. После инкубации перенесите трубку на лед и произведите ультразвуковую обработку раствора на частоте 20 кГц, амплитуда 70%, импульс включен в течение 3 секунд, импульс выключен в течение 3 секунд и пять импульсов за раунд. Обрабатывайте раствор ультразвуком в течение шести раундов и дайте ему остыть на льду между раундами.
7. Центрифугируйте раствор при 24 000 x g в течение 15 мин при 4 °C. Выбросьте надосадочную жидкость и повторите шаги 1,5-1,7 один раз. Храните гранулы при температуре -20 °C или продолжайте шаг 1,8.
8. Приготовьте буфер A (500 мМ NaCl (хлорид натрия), 20 мМ Tris-HCl (трис (гидроксиметил)аминометан гидрохлорид), 5 мМ имидазола, pH 7,9) путем добавления 0,8766 г NaCl, 0,09456 г Tris-HCl и 0,01021 г имидазола в стакан объемом 100 мл. Добавляйте воду до тех пор, пока объем не достигнет 28 мл, затем отрегулируйте pH раствора до 7,9. Затем перелейте раствор в мерный цилиндр объемом 100 мл и добавьте воду до тех пор, пока объем не составит 30 мл.
9. Суспендируйте гранулу со стадии 1,7 в 30 мл буфера А и инкубируйте этот раствор при температуре 4 °C в течение 3 часов. За это время отвесить 17,2 г гуанидина-гидрохлорида.
10. Проведите ультразвуковую обработку раствора на льду, используя те же настройки, что и в пункте 1.6. Затем добавьте в раствор 17,2 г гуанидина-HCl. Инкубируйте его на льду в течение 1 часа, чтобы растворить белок MOGtag.
11. Центрифугируйте раствор при концентрации 24 000 x g в течение 30 мин при 4 °C. Соберите надосадочную жидкость и храните надосадочную жидкость при температуре 4 °C до очистки белка.

2. Очистка белка

ПРИМЕЧАНИЕ: На следующих этапах белок MOGtag будет очищен путем 4 раундов абсорбции на заряженной никелевой смоле (через His-tag) и элюирования.

1. Создайте следующие буферы:
   1. Подготовьте буфер B (500 мМ NaCl, 20 мМ Tris-HCl, 5 мМ имидазол, 6 М гуанидин-HCl, pH 7,9). Добавьте 5,844 г NaCl, 0,6304 г Tris-HCl, 0,0681 г имидазола и 114,64 г гуанидин-HCl в 500 мл стакана. Затем добавьте воды, пока она не достигнет 190 мл и отрегулируйте pH до 7,9. Перелейте раствор в мерный цилиндр объемом 250 мл и добавьте воду до тех пор, пока объем не составит 200 мл.
   2. Приготовьте элюирующий буфер (500 мМ NaCl, 20 мМ Tris-HCl, 0,5 М имидазола, 6 М гуанидин-HCl, pH 7,9). Добавьте 5,844 г NaCl, 0,6304 г Tris-HCl, 6,808 г имидазола и 114,64 г гуанидин-HCl в стакан объемом 500 мл. Добавляйте воду, пока она не достигнет 190 мл, и отрегулируйте pH до 7,9. Перелейте раствор в мерный цилиндр объемом 250 мл и добавьте воду до тех пор, пока объем не составит 200 мл.
   3. Приготовьте полосковый буфер (500 мМ NaCl, 20 мМ Tris-HCl, 100 мМ ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота), pH 7,9). Добавьте 5,844 г NaCl, 0,6304 г Tris-HCl, 40 мл 500 мМ ЭДТА в 500 мл стакана. Добавляйте воду до тех пор, пока она не достигнет 190 мл, и отрегулируйте pH до 7,9. Перелейте раствор в мерный цилиндр объемом 250 мл и добавьте воду до тех пор, пока объем не составит 200 мл.
   4. Приготовьте шихтовый буфер (0,1 М сульфата никеля). Добавьте 5,257 г сульфата никеля в стакан объемом 500 мл и добавьте воды, пока он не достигнет 190 мл (ВНИМАНИЕ, не обрабатывайте сульфат никеля вне вытяжного шкафа, пока сульфат никеля не растворится в воде). Как только сульфат никеля растворится, перелейте раствор в мерный цилиндр объемом 250 мл и добавьте воды, пока объем не достигнет 200 мл.
2. Разделите 10 мл никелевой смолы между двумя коническими центрифужными пробирками объемом 50 мл, способными выдерживать центробежные силы более 4 500 x g (по 5 мл в каждой пробирке).
3. Зарядите и уравновесьте никелевую смолу:
   1. Промойте смолу, добавив 40 мл воды в каждую трубку, содержащую смолу. Положите трубки горизонтально на коромысло и дайте им помешать в течение 5 минут при температуре 4 °C. По окончании центрифугируйте пробирки при давлении 4 500 x g в течение 8 минут при 4 °C.
   2. Выбросьте надосадочную жидкость с помощью пипетирования, чтобы не повредить гранулу. Добавьте 40 мл буфера для заряда в каждую пробирку. Переложите трубки на коромысло и дайте им помешать в течение 15 минут при температуре 4 °C. По окончании центрифугируйте пробирки при давлении 4 500 x g в течение 8 минут при 4 °C.
   3. Выбросьте надосадочную жидкость, затем добавьте в пробирки 40 мл буфера В. Переложите трубки на коромысло и дайте им помешать в течение 5 минут при температуре 4 °C. После этого центрифугируйте пробирки при давлении 4 500 x g в течение 8 минут при 4 °C, затем выбросьте надосадочную жидкость.
4. Дополнительно: Возьмите 150 мкл растворенного белка, собранного на этапе 1.11, и переложите его в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл. Пометьте пробирку как прединкубационную и заморозьте ее при температуре -20 °C для последующего анализа SDS (додецилсульфата натрия) (Рисунок 2, Crude MOGtag).
5. Очистите MOGtag Protein:
   1. Перенесите весь объем солюбилизированного белка с шага 1.11 (~40 мл, за вычетом небольшого образца, удаленного на шаге 2.4) в первую пробирку (рис. 1, пробирка 1), содержащую никелевую смолу, с шага 2.3, перемешайте и поместите горизонтально на коромысло при температуре 4 °C на 1 час.
   2. Центрифугируйте пробирку при давлении 4 500 x g в течение 8 минут при 4 °C. По завершении перенесите надосадочную жидкость во вторую пробирку (рис. 1, пробирка 2) с никелевой смолой и инкубируйте, как описано на предыдущем этапе. Тем временем выполните шаги с 3 по 6 ниже с трубкой 1.
   3. Суспендируйте никелевую смолу в тубе 1 на 40 мл элюирующего буфера и поместите трубку горизонтально на коромысло при температуре 4 °C на 5 минут. Затем центрифугируйте пробирку при давлении 4 500 x g в течение 8 минут при 4 °C.
   4. Перелейте надосадочную жидкость, содержащую элюированный белок MOGtag, во флакон объемом 250 мл с надписью «очищенный белок MOGtag» и держите этот флакон при температуре 4 °C. На каждом этапе элюирования скапливайте полученную надосадочную жидкость в этом флаконе.
   5. Добавьте 40 мл полосового буфера в никелевую смолу и положите горизонтально на коромысло на 5 минут при температуре 4 °C.
   6. Центрифугируйте пробирку при давлении 4 500 x g в течение 8 минут при 4 °C. Выбросьте надосадочную жидкость, затем зарядите никелевую смолу, как указано в шаге 2.3.
   7. Когда закончите, перейдите ко второй трубке, как указано в шаге 2.5. В общей сложности 4 раунда абсорбции солюбилизированного белка из стадии 1.11 на заряженную никелевую смолу и элюирование позволят восстановить большую часть белка, хотя, при желании, дополнительный белок может быть восстановлен в дополнительных раундах абсорбции и элюирования.
6. После завершения четырех (или более) циклов абсорбции и элюирования храните объединенный очищенный белок при температуре 4 °C в течение ночи. Никелевую смолу можно хранить в 40 мл 20% раствора этанола при температуре 4 °C до тех пор, пока она снова не понадобится.

Результаты

Рисунок 1: Обзор шагов, необходимых для производства чистого белка MOGtag. Для получения белка MOGtag бактерии, экспрессирующие белок MOGtag, выращивают до высокой плотности, а затем индуцируют экспрессию MOGtag с помощью IPT...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
BL21 E.coli- pet32-MOGtag	Kerfoot lab		Эти бактерии необходимы для производства белка MOGtag. Запасы глицерина этих бактерий доступны по запросу.
LB бульонный мельница	Bioshop	LBL407.1
Ампициллин	Bio basic	AB0028	Восстановите порошок до 50% этанола / 50% H₂O в концентрации 100 мг/мл. Хранить при -20 °C.
IPTG	Bioshop	IPT002.5	Восстановите порошок в H₂O при 1М и храните при -20 °C.
Лизоцим курицы-яйца	Bioshop	LYS702.10	восстанавливают в H₂O в концентрации 50 мг/мл и хранят при -80 °C.
Triton-X100	Sigma	T-8532
Фосфатный буферный раствор	Life technologies	20012-027	Коммерческий фосфатный буферный раствор не требуется, достаточно любого стандартного лабораторного фосфатного буферного раствора.
Хлорид натрия	Bioshop	SOD004.1
Tris-HCl	Bioshop	TRS002.1
Имидазол	Bioshop	IMD508.100
Guanidine-HCl	Sigma	G3272	Качество должно быть более 98% чистоты.
0,5M EDTA	bioshop	EDT111.500
Сульфат никеля (II)	Bioshop	NIC700.500
Его связующая смола	EMD Millipore	69670-3	Хранить в 20% этаноле 80% H₂O при 4 °C
Безводный этанол	Коммерческие спирты	P016EAAN	разбавить водой по мере необходимости.
Ледяная уксусная кислота	Bioshop	ACE222.1
Тригидрат ацетата натрия	Bioshop	SAA305.500
Бычий сывороточный альбумин стандартный	bio-rad	500-0206
Этилендиамина тетрауксусная кислота, дигидрат динатриевой соли Fisher	scientific	BP120-500
Полиэтиленгликоль 3350	Bioshop	PEG335.1
полиэтиленгликоль 8000	Bioshop	PEG800.1
Ультразвуковой аппарат	Fisher Scientific	FB-120-110
Додецилсульфат натрия	Bioshop	SDS001