Регулирование роста шванновских клеток in vitro с помощью метода наносекундного импульсного электрического поля

Аннотация

Источник: Han, J., et.al. Регулирование роста шванновских клеток с помощью наносекундного импульсного электрического поля для регенерации периферических нервов in vitro. J. Vis. Exp. (2024)

В этом видео демонстрируется применение метода наносекундного импульсного электрического поля (nsPEF) для модуляции роста шванновских клеток (SC). Быстрые электрические импульсы индуцируют переходные нанопоры в мембранах СК, способствуя притоку кальция, который активирует сигнальные пути, управляющие пролиферацией, дедифференцировкой и секрецией нейротрофического фактора СК. Эти клеточные реакции усиливают поддержку аксонов, выживаемость нейронов и потенциальную миелинизацию, что делает nsPEF многообещающим инструментом для восстановления нервов.

Протокол

1. Размораживание криоконсервированных клеток RSC96

1. : Разморозьте криовиал, содержащий 1 мл клеточной суспензии, быстро встряхнув его на водяной бане при температуре 37 °C, а затем добавьте его в центрифужную пробирку, содержащую 4-6 мл готовой питательной среды, и хорошо перемешайте.
2. Центрифугируйте при 1000 x g в течение 3-5 минут, выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клетки в 3 мл готовой питательной среды.
3. Клеточную суспензию добавить в культуральную колбу (или чашку), содержащую 6-8 мл полной питательной среды, и инкубировать при 37 °С в течение ночи.
4. На следующий день понаблюдайте за ростом и плотностью клеток под микроскопом.

2. Прохождение клеток:

ПРИМЕЧАНИЕ: Если плотность клеток достигает 80%-90%, они готовы к прохождению.

1. Откажитесь от питательной среды и промойте клетки 1-2 раза фосфатно-солевым буфером (PBS) без ионов кальция и магния.
2. Добавьте 0,25% (масс./об.) трипсина-0,53 мМ ЭДТА в колбу для культур (1-2 мл для колбы Т25, 2-3 мл для колбы Т75) и инкубируйте при 37 °С в течение 1-2 мин.
3. Понаблюдайте за отслоением клеток под микроскопом. Если большинство клеток стали круглыми и отделились, быстро верните колбу в рабочую зону, осторожно постучите по колбе и добавьте 3-4 мл питательной среды, содержащей 10% FBS, чтобы остановить пищеварение.
4. Смешайте содержимое, отасуньте раствор и центрифугируйте при 1000 x g в течение 5 минут. Затем выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клетки, добавив 1-2 мл свежей питательной среды и осторожно пипетируйте.
5. Перенесите клеточную суспензию в новую колбу T25 в соотношении 1:2 и добавьте 7 мл питательной среды.

3. Работа устройства nsPEF

1. Суспендируйте клетки RSC96 в 1 мл питательной среды DMEM и перенесите их в колориметрические чашки с электродами с обеих сторон.
2. Включите выключатель питания.
3. Отрегулируйте параметры, вращая ручку на приборе, чтобы изменить интенсивность электрического поля. Интенсивности, установленные в этом исследовании, составляют 5 кВ/см, 10 кВ/см, 20 кВ/см и 40 кВ/см.
4. Осторожно вращайте электроды до появления искр, позволяя элементам получить 5 импульсов nsPEF в соответствии с заданной интенсивностью поля, прежде чем немедленно разделить два электрода.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Высоковольтный источник питания для nsPEF	Matsusada Precision Inc.	AU-60P1.6-L
Пипетка	Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD
RSC96 Schwann cells	Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD	STCC30007G-1
Сканер	3DHISTECH	Pannoramic MIDI
Специальный кабель для nsPEF	Times Microwave Systems	M17/78-RG217