Инъекция вирусного вектора в спинной мозг крысы для ретроградного прослеживания нейронов

Аннотация

Источник: Keefe, K. M., et al. Прямое введение лентивирусного вектора выделяет множественные двигательные пути в спинном мозге крысы. J. Vis. Exp. (2019).

В этом видео демонстрируется инъекция высокоэффективного ретроградного транспортного вирусного вектора (HiRet) в спинной мозг крысы для отслеживания нейронных путей. Вирус имеет гликопротеины для синаптического входа и ген, кодирующий флуоресцентный белок. Игла вводится в спинной мозг, и вирусная суспензия вводится с контролируемой скоростью. Игла окончательно извлекается после того, как у нее будет достаточно времени для диффузии вируса.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными моделями, были рассмотрены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным советом JoVE.

1. Предоперационная подготовка

1. Подготовьте вытянутые стеклянные иглы для вирусной инъекции за несколько дней до операции с помощью стеклянных капиллярных пипеток объемом 3,5 нанолитра, предназначенных для нанолитровых инжекторов. Натяните каждую пипетку на двухступенчатый съемник игл в соответствии с инструкциями производителя для создания шаблонов с двумя иглами.
2. Доработайте кончик шаблона иглы, отрезав микроножницами примерно 1-2 мм лишнего стекла. Измерьте примерный размер апертуры под микроскопом с помощью калибровочного предметного стекла микроскопа, чтобы выделить иглы с апертурой 30-40 мкм.
3. Расположив иглу под углом 30°, используйте фаску для микропипетки, чтобы создать наконечник с отверстием 30-40 мкм и скошенным углом 45°. Проверьте ширину апертуры с помощью шкалы Нониуса на калибровочном предметном стекле. Пропустите воду и этанол через стеклянную иглу с помощью шприца с гибкой насадкой, чтобы смыть мусор, и отметьте иглу через равные промежутки времени черным маркером.
4. Поместите иглы в закрытую чашку Петри, предварительно очищенную 70% этанолом, и стерилизуйте в течение 30 минут в колпаке биобезопасности под ультрафиолетовым или ультрафиолетовым светом.
5. Приготовьте высокоэффективный лентивирус ретроградного транспорта (HiRet), удалив подходящий объем из морозильной камеры непосредственно перед процедурой.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Подходящий объем включает в себя количество, необходимое для инъекции (1 μл на инъекцию x количество инъекций), а также небольшое количество дополнительного объема для учета потерь при пипетировании и нагрузке. Транспортируйте и храните вирус на льду, когда он не используется.
6. Подготовьте инжектор, вставив его в микронасос и поместив в микроманипулятор с нониусной шкалой.
7. Чтобы подготовить стеклянную иглу, осторожно загрузите цветной краситель, такой как красное масло, в шприц, оснащенный гибкой иглой. Следите за тем, чтобы в игле не осталось пузырьков. При обращении с иглой используйте асептическую технику и воздержитесь от прикосновения к кончику.
8. Вставьте стеклянную иглу в инжектор, убедившись, что игла правильно установлена в шайбы, колпачок инжектора плотно завинчен, а стальная игла инжектора удлиняется примерно на 3/4 длины стеклянной иглы. Вирусы могут быть загружены в иглу на более позднем этапе.

2. Анестезия и подготовка места операции

1. : Взвесьте животное на цифровых весах. Запишите предоперационный вес, чтобы определить необходимый объем анестетика и обеспечить мониторинг веса после операции. В этом протоколе использовались самки крыс Спрэг-Доули, примерно 200–250 г.
2. Обезболите крысу с помощью ингаляции изофлурана или инъекционного раствора кетамина/ксилазина (k/x). Здесь кетамин вводится внутрибрюшинно в дозе 67 мг/кг, а ксилазин — в дозе 6,7 мг/кг.
3. Подтвердите подходящую плоскость анестезии, сильно зажав ногу. Если происходит рефлекторное прерывание, подождите еще несколько минут, прежде чем продолжить.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Также наблюдайте за усами, глазами и частотой дыхания на предмет признаков сознания. Если усы подергиваются, глаз моргает при легком прикосновении или дыхание учащенное и поверхностное, подождите, пока плоскость анестезии станет глубже, чтобы продолжить протокол. Кроме того, следите за этими признаками на протяжении всей ламинэктомии и инъекционной хирургии. Если у животного наблюдается неглубокая анестезиологическая плоскость, сделайте бустерную инъекцию только кетамина, равную 1/2 первоначальной дозы k/x.
4. Брейте крысу по спинной средней линии от бедер до нижнего угла лопаток. Натяните кожу животного для более легкого и точного бритья.
5. Нанесите офтальмоглазную мазь на оба глаза.
6. Нанесите антисептик на выбритый участок, чтобы простерилизовать участок. Для первого скраба смочите стерильную марлю 5% раствором йода и сотрите все волосы и мусор. Затем проведите в одном направлении стерильной марлей, смоченной в 70% этаноле, чтобы ни одна область не соприкасалась дважды. Используйте эту же технику, чередуя йод и пропитанную этанолом марлю еще дважды.

3. Хирургическое поле и подготовка инструмента

1. Подготовьте набор автоклавных хирургических инструментов, который включает в себя скальпель, ронжеры, щипцы для крысиных зубов, пружинные ножницы, гемостаты, изогнутые щипцы со средней точкой и ретракторы или утяжеленные крючки, развернув стерильную пленку для создания стерильного поля.
2. Откройте упаковку стерильных хирургических перчаток и положите стерильную перчаточную пленку на стол. Используйте это как дополнительное стерильное поле для используемых инструментов, чтобы предотвратить загрязнение стерильной пленки.
3. Бросьте лезвие скальпеля #10 на стерильное поле. Закрепите лезвие на рукоятке с помощью гемостатика. Расположите стерильный физиологический раствор, хромовый кетгутовый шов 4,0 и материалы для остановки кровотечения, такие как прижигатель, стерильная марля, стерильные аппликаторы с ватными наконечниками (при мышечных кровотечениях), гельпену или костный воск (при костных кровотечениях) в доступном месте.
4. Достаньте животное и положите его на стерильную ткань. Подложите марлю под мочевой пузырь для сбора мочи. Подперейте целевую область свернутым полотенцем под животом. Если возможно, поместите хирургическую грелку под стерильную ткань, особенно для более длительных процедур.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Стерильность важна во время операции по выживанию. Держите под рукой пульверизатор с 70% этанолом, чтобы поддерживать стерильность рук в перчатках, и используйте стерилизатор с шариками, если стерильность инструментов нарушена, или между отдельными операциями.

4. Обнажение позвоночного столба и определение места ламинэктомии

1. Определите область, где будет сделан разрез кожи, осторожно надавливая пальцами на последнее ребро, чтобы найти поясничный или L1 позвонок. Используя это в качестве ориентира, сделайте разрез кожи на 3-4 см хирургическим скальпелем #10, заканчивающимся чуть ниже L1, чтобы обнажить мышцу. Удерживайте кожу в напряженном состоянии, осторожно раздвигая и сильно нажимая лезвием скальпеля, чтобы обеспечить чистый разрез.
2. При необходимости разрежьте и распределите поверхностный жир с помощью щипцов и ножниц. (В зависимости от целевого позвонка, может быть или не быть большого жирового пакета, находящегося на поверхности мышцы.)
3. Нащупайте остистые отростки плоской рамкой лезвия скальпеля или пальцем. Часто область средней линии будет очерчена буквой «V» белой фасции с обеих сторон. Сделайте небольшой ростральный надрез, чтобы освободить место для надежного захвата верхнего отростка щипцами из крысиных зубов, затем сделайте два длинных глубоких надреза как можно ближе к отростку. В самой глубокой точке разреза лезвием скальпеля можно прощупать тыльную поверхность позвонков.
4. Удерживайте боковые мышцы в стороне с помощью втягивающих устройств или утяжеленных крючков для улучшения видимости. Расчистите мышцы вокруг отростков с помощью скальпеля, пружинных ножниц или ронжеров, чтобы определить форму их головы.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Помните, что спинной мозг не простирается по всей длине позвоночного столба, так как ткань спинного мозга прекращает расти в развитии раньше, чем костная. Это означает, что целевой уровень позвоночника может находиться под позвонком с другим названием.
5. Найдите грудной отдел или Т11 и прилегающие отростки Т12 и Т13.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Помощь в определении правильных уровней позвонков может быть найдена в атласе спинного мозга крысы и в предыдущих исследованиях, описывающих ориентиры у мыши, которая имеет очень похожую структуру позвонков6,33. Оставьте ростральный остистый отросток, такой как Т9, нетронутым, чтобы дать ориентир по средней линии.

5. Выполнение ламинэктомии

1. После того, как целевая область была правильно определена, выполните ламинэктомию дорсальных аспектов T11-T13. Аккуратно раздвиньте позвонки, чтобы обнажить межпозвоночные связки, которые являются хорошими местами для вставки ронжеров для первоначального прикуса кости. Удерживайте ронжеры в полузакрытом положении, чтобы повысить точный контроль.
2. Удалите остистые отростки и дорсальную часть позвонков, нанося небольшие укусы ронжёрами. Будьте осторожны, чтобы не повредить спинной мозг и не потревожить твердую мозговую оболочку. Слегка приподнимите щипцы для зубов крысы, чтобы помочь оттянуть спинной мозг от позвонков и уменьшить склонность к ударам о ткани спинного мозга.
3. Удалите кость подальше от средней линии, чтобы можно было наблюдать средний кровеносный сосуд. Оставьте окошко, в котором четко видна ткань спинного мозга и нет мусора.
4. Аккуратно прикоснитесь щипцами к спинному мозгу. Некоторые животные могут рефлекторно прыгать, даже если их анестезиологический уровень глубокий. Нанесите несколько капель обезболивающего средства, такого как лидокаин, непосредственно на спинной мозг, чтобы предотвратить скачки во время процедуры инъекции.
5. Закрепите животное в спинальном держателе, закрепив стабилизирующие щипцы к остистым отросткам ростральным и каудальным к окну ламинэктомии. Поднимите живот животного с помощью спинного держателя, чтобы свести на нет эффект дыхательных движений. Это повысит стабильность иглы и обеспечит соответствующую глубину инъекции.

6. Загрузка вируса и позиционирование инжектора

1. Загрузите вирус в инжектор, пипетируя примерно 5 мкл на кусок парапленки и расположив иглу так, чтобы наконечник находился внутри капли.
2. С помощью микропомпы можно вывести до 4 мкл вируса со скоростью 20–100 нл/с.
3. Настройте контроллер на инъекцию и выпуск небольшого количества вируса из иглы, чтобы кончик иглы не был заблокирован. Сотрите излишки вируса с помощью лабораторной салфетки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы стеклянным пипеткам можно использовать шприц Hamilton со стальной иглой.
4. Расположите микроманипулятор так, чтобы была видна шкала нониуса, и расположите иглу на средней линии спинного мозга.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Средняя линия иногда может быть расположена у крупного кровеносного сосуда, проходящего на передней поверхности спинного мозга. Однако у отдельных крыс этот показатель может варьироваться, и нацеливание на срединную линию должно быть подтверждено сравнением с интактным остистым отростком.
5. Направьте иглу в сторону на 0,8 мм с помощью нониусной шкалы на микроманипуляторе.
6. Опустите иглу к спинному мозгу до тех пор, пока она не будет вдавливать, но не прокалывать твердую мозговую оболочку. Быстрыми вращающими движениями проколите твердую мозговую оболочку иглой до тех пор, пока она не углубится на глубину 1,5 мм.

7. Введение вируса в спинной мозг

1. После установки иглы запрограммируйте инъектор на инъекцию со скоростью 400 нл/мин. Подтвердите, что вирус проникает в спинной мозг, наблюдая за развитием фронта красителя. Не должно быть явного подтекания или выпячивания тканей спинного мозга. Если наблюдается утечка, ее иногда можно уменьшить, снизив скорость впрыска до 200 нл/мин.
2. После завершения инъекции дайте игле отдохнуть в спинном мозге в течение 2–5 минут (в зависимости от объема инъекции), чтобы облегчить диффузию вируса.
3. Медленно извлеките иглу и перейдите к следующему месту инъекции. Введите по 1 мкл вируса в каждый из 6 равномерно расположенных участков на расстоянии примерно 1 мм друг от друга по длине спинномозговой ткани L1-L4. Одна и та же игла может использоваться для каждой инъекции до тех пор, пока она продолжает функционировать должным образом.

8. Закрытие раны и послеоперационный уход

1. Снимите животное с держателя позвоночника и выньте ретракторы или крючки, используемые для распределения боковых мышц. Перед закрытием убедитесь, что рана очищена от мусора.
2. Сшить мышцу с помощью хромового кетгутового шва 4.0. Разрежьте шовные нити близко к узлу, чтобы снизить вероятность внутреннего раздражения кожи.
3. Скрепите кожу скобами с помощью раневых зажимов диаметром 9 мм. Чтобы обеспечить оптимальное заживление, выровняйте края кожи перед наложением швов.
4. Положите животное на водоконвекционную подогревную подушку и следите за происходящим до тех пор, пока не проснется.
5. Введите подкожно 5–10 мл стерильного физиологического раствора для восполнения жидкости и антибиотик, такой как цефазолин, для предотвращения инфекции. Когда животное начнет передвигаться, поместите его обратно в домашнюю клетку и дайте ему начальные анальгетики. Наблюдайте за крысами на предмет любых признаков боли и стресса и лечите в соответствии с процедурой, одобренной вашим институциональным комитетом по уходу и использованию животных (IACUC) для облегчения боли.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
#10 Лезвия скальпеля	Roboz	RS-9801-10	Для использования со скальпелем.
1 мл шприцев	Becton, Dickinson and Company	309659	Для инъекций анестетика, потенциальных бустерных инъекций анестетика и инъекций антибиотиков.
Шприцы 10 мл	Becton, Dickinson and Company	309604	Для введения физиологического раствора животному после операции.
4.0 Хромовый кетгутовый шовный материал	DemeTECH	NN374-16	Для повторного связывания мышц во время закрытия.
48000 Устройство для снятия фаски с микропипетками	World Precision Instruments	32416	Используется для снятия фаски с кончиков натянутых стеклянных капиллярных трубок с образованием функциональных стеклянных игл.
5% раствор йода	Purdue Products L.P.	L01020-08	Для использования при стерилизации операционного поля.
70% этанол	Н/Д	Н/Д	Для стерилизации вновь подготовленных стеклянных игл, животных моделей во время хирургической подготовки и рук хирурга во время операции, а также для всех других незначительных мер по поддержанию стерильности.
Анестетик (раствор кетамина/ксилазина)	Zoetis	240048	Для удержания животного в правильной плоскости сознания во время операции.
Антибиотик (цефазолин)	West-Ward Pharmaceuticals	NPC 0143-9924-90	Для подкожного введения для предотвращения инфекции после операции.
Стерилизатор шариков	CellPoint	5-1450	Для термической стерилизации хирургических инструментов.
Bonewax	Fine Science Tools	19009-00	Для запечатывания кости в случае костного кровотечения.
Cacterizer	Fine Science Tools	18010-00	Для герметизации любых артерий или вен, разорванных во время операции, чтобы предотвратить чрезмерную кровопотерю.
Цифровые весы	Okaus	REV.005	Для взвешивания животного во время хирургической подготовки.
Гибкая насадка для игл	World Precision Instruments	MF34G-5	Для очистки стеклянных игл и загрузки красного масла в стеклянные иглы.
Гель-пена	Pfizer	H68079	Для герметизации кости в случае костного кровотечения.
Стеклянные капиллярные трубки	World Precision Instruments	4878	Для тянутых стеклянных игл - должны быть рассчитаны на нанолитровые инжекторы.
Машинки для стрижки волос	Oster	111038-060-000	Для очистки хирургического участка от волос.
Гемостаты	Roboz	RS-7231	Для общего применения в хирургии.
Kimwipes	Kimtech	34155	Для общего использования в хирургии.
Изогнутые щипцы со средней точкой	Roboz	RS-5136	Для общего использования в хирургии.
Микроманипулятор с нониусной шкалой	Kanetec	N/A	Для точного наведения во время операции.
Микроножницы	Roboz	RS-5621	Для резки стекла отсчитываются от только что выдернутых стеклянных капиллярных трубок.
Микроскоп со световым и нониусным масштабом Окулярный	Leitz Wetzlar	N/A	Используется для визуализации и измерения скоса стеклянных капиллярных трубок в функциональные стеклянные иглы.
Контроллер насоса MicroSyringe	Precision Instruments	62403	Для контроля скорости впрыска.
Nanoliter 2000 Pump Head Injector	World Precision Instruments	500150	Для загрузки и впрыска вирусов контролируемым образом.
Съемник игл	Narishige	PC-100	Для нагрева и раздвигания стеклянных капиллярных трубок с образованием стеклянных игл.
Офтталамическая мазь	Dechra Veterinary Products	RAC 0119	Для защиты глаз животного во время хирургического вмешательства.
Парапленка	Bemis	PM-996	Для помощи при загрузке вируса в наноинъектор.
Иглы PrecisionGlide (25G x 5/8)	Becton, Dickinson and Company	305122	Для использования со шприцами объемом 1 мл и 10 мл для введения в животную модель.
Щипцы для зубов крысы	Roboz	RS-5152	Для захвата остистых отростков.
Красное масло	Н/Д Н	/Д	Для обеспечения фронта для визуализации вируса, проникающего в ткани во время инъекции.
Втягивающие устройства	Roboz	RS-6510	Для удержания открытой операционной раны.
Rimadyl Tablets	Bio Serv	MP275-050	Для обезболивания после операции.
Rongeurs	Roboz	RS-8300	Для удаления мышц позвоночного столба во время операции.
Рукоятка лезвия скальпеля	Roboz	RS-9843	Для разрезания кожи и жировой подушки животной модели во время операции.
Ножницы	Roboz	RS-5980	Для общего использования в хирургии.
Зажимы для ран Stainless Steal	CellPoint	201-1000	Для связывания кожи операционной раны во время закрытия.
Щипцы для снятия скоб	Kent Scientific	INS750347	Для удаления скоб, если они были наложены неправильно.
Стерильная салфетка	Phenix Research Products	BP-989	Для обеспечения стерильной поверхности для проведения операции.
Стерильные аппликаторы с ватным наконечником	Puritan	806-WC	Для впитывания крови в операционной ране при сохранении стерильности.
Стерильная марля	Covidien	2146	Для очистки хирургической области и хирургических инструментов с сохранением стерильности.
Стерильный физиологический раствор	Baxter Healthcare Corporation	281324	Для использования при очистке крови и для замены жидкостей после операции.
Хирургические перчатки	Н/Д	Н/Д	Для использования хирургом для поддержания стерильного поля во время операции.
Хирургическая грелка	Н/Д	/Д	Для поддержания температуры тела животного модели во время операции.
Хирургический микроскоп	Н/Д Н	/Д	Для улучшенной визуализации операционной раны.
Хирургический степлер	Kent Scientific	INS750546	Для наложения скоб.
T/Pump Heat Therapy Водяной насос	Gaymar	TP500C	Для закачки теплой воды в нагревательную прокладку с конвекцией воды.
Прокладка для согревания воды с конвекцией	Baxter Healthcare Corporation	L1K018	Для использования в послеоперационной зоне восстановления для поддержания температуры тела животного, находящегося в бессознательном состоянии.
Утяжеленные крючки	Н/Д	Н/Д	Для удержания открытой операционной раны.

World Н