Высокоинтенсивный сфокусированный ультразвук для блокирования потенциалов действия нервов в модели крысы с диабетом

Аннотация

Источник: Lee, Y. F., et al. Ультразвуковой инструмент для блокады нервной проводимости на моделях крыс с диабетом. J. Vis. Exp. (2017)

В этом видео демонстрируется использование высокоинтенсивного сфокусированного ультразвука (HIFU) для блокирования потенциалов действия от седалищного нерва к икроножной мышце в модели крысы с диабетом. После доставки луча HIFU к нерву снижение мышечного сигнала подтверждает потенциал HIFU в качестве неинвазивной терапии для облегчения диабетической нейропатической боли.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными моделями, были рассмотрены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным советом JoVE.

1. Блокада нервной проводимости in vivo с помощью высокоинтенсивного сфокусированного ультразвука (HIFU)

ПРИМЕЧАНИЕ: Эксперимент in vivo начинается на 5-й неделе после инъекции стрептозотоцина (STZ) в дозе 50 мг/кг.

1. Выполняйте процедуры на животных перед блокированием сложных потенциалов мышечного действия (CMAP) с помощью ультразвуковой обработки HIFU.
   1. Перед операцией простерилизуйте хирургические инструменты (скальпель, ножницы, щипцы и стеклянный крючок) в автоклаве
   .
   2. Обезболивание крыс осуществляется путем внутрибрюшинной инъекции смеси тилетамина/золазепама (40 мг/кг) и ксилазина (10 мг/кг) или путем ингаляции 1,75% изофлурана через испаритель изофлурана. Поместите крыс на грелку, чтобы поддерживать температуру их тела.
   3. Расположите крыс для операции в вентральном положении лежа. Нанесите глазную мазь. Вытяните ногу крысы и прищипните подошвенную поверхность стопы ногтями, чтобы убедиться в глубине анестезии. Если у крыс проявляются реакции отмены, примените дополнительную анестезию.
   4. Удалите шерсть с бедра и нижней части спины крыс с помощью электрической машинки для стрижки. Нанесите жидкий йод с помощью чистой марли на место операции и кругово переместите марлю наружу от места операции. С помощью спиртовой салфетки протрите жидкий йод теми же круговыми движениями. Этот эксперимент проводится на левом и правом хирургических участках. Повторите процедуру на другом месте операции при выполнении следующего этапа процедуры.
   5. С помощью стерильных хирургических ножниц или скальпеля сделайте разрез кожи на тыльной стороне бедра. С помощью тупых хирургических ножниц аккуратно отделите ткань под кожей и закрепите кожу крючками. Бедренную кость можно увидеть внутри мышц.
   6. С помощью ножниц аккуратно разделите мышцы, параллельные бедренной кости, пока не станут видны волокна седалищного нерва средней части бедра, которые встроены в мышцы. Осторожно используйте стеклянный крючок, чтобы отделить седалищный нерв средней части бедра от окружающих соединительных тканей и мышц.
2. Расположите седалищный нерв в фокальной зоне HIFU с помощью специально изготовленного фиксатора нерва (Рисунок 1 и Рисунок 2).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Изготовленный на заказ фиксатор нерва состоит из 3 компонентов (Рисунок 2). Все компоненты изготовлены из прозрачного полиметилметакрилата (ПММА). Наружная резьба верхней конструкции компонента I имеет высоту 2,5 мм и M10XP0,7 (рис. 3A). Центральный колодец представляет собой отверстие диаметром 4,0 мм, проходящее через компонент I. Нижнее отверстие колодца заклеивается листом скотча. Диаметр прорези составляет 1,2 мм, а расстояние между центральной плоскостью прорези и верхней поверхностью компонента I – 3,1 мм. Компонент II состоит из основного корпуса, четырех опор и нижней конструкции (рисунок 3B). Внутренняя резьба нижней конструкции имеет высоту 2,5 мм и M10XP0,7 подходит к наружной резьбе компонента I. Диаметр центрального отверстия такой же, как и у центрального отверстия компонента I. Размеры основного корпуса составляют 32 мм в диаметре и 5,4 мм в толщину. Четыре ножки развернуты симметрично. Две одинаковые короткие ножки предназначены для выравнивания, а две одинаковые длинные ножки работают для зацепления за компонент III. Внешний диаметр и высота компонента III составляют 41 мм и 9,2 мм. Внутренняя резьба M36XP1.0, а сквозное отверстие имеет диаметр 27,5 мм (Рисунок 3C). Конус представляет собой полый конус с верхним отверстием диаметром 84 мм и нижним отверстием диаметром 27,5 мм. Высота составляет 57,5 мм (рис. 4А).
   1. Перед экспериментом замочите изготовленный на заказ акриловый фиксатор нервов в растворе отбеливателя на 30-60 минут, а затем замочите в стерильной воде.
   2. С помощью стеклянного крючка осторожно приподнимите нерв и вставьте его в щель компонента I.
   3. Прикрутите компонент II к компоненту I. Заполните центральную лунку компонента I раствором Рингера для ультразвукового распространения и сохранения нервов.
   4. Прикрутите компонент III к конусу корпуса HIFU. Состыкуйте компонент III с компонентом II через четыре ножки компонента II.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Геометрический центр трех компонентов и преобразователь выровнены. Расстояние между нервом и датчиком равно фокусному расстоянию, что обеспечивает нахождение нерва внутри фокальной зоны HIFU.
3. Вставьте одну пару акупунктурных игл в начало седалищного нерва, а другую пару – в икроножную мышцу. Подключите каждую пару игл к системе электрофизиологического сбора данных через электрический коаксиальный кабель (Рисунок 1).
   ПРИМЕЧАНИЕ: На одном конце кабеля находятся два зажима типа «крокодил» для раздельного зажима двух игл, а на другом конце кабеля находится байонетный разъем Нила-Консельмана (BNC) для соединения системы. Пары акупунктурных игл работают как стимулирующие электроды на седалищном нерве и регистрирующие электроды на икроножной мышце.
   1. Установите частоту дискретизации и пропускную способность системы электрофизиологического сбора данных на 50 кГц и 70 Гц-3 кГц соответственно. Подайте сверхмаксимальный стимул с длительностью импульса 0,1 мс на стимулирующие электроды в начале седалищного нерва.
   2. Запишите CMAP с регистрирующих электродов и усилите CMAP с помощью встроенного усилителя в системе электрофизиологического сбора данных.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте встроенный усилитель в системе электрофизиологического сбора данных для усиления нервных сигналов и записи CMAP с регистрирующих электродов с помощью системы электрофизиологического сбора данных.
4. Используйте коммерческий преобразователь HIFU с частотой 2,68 МГц для подавления CMAP у диабетических нейропатических крыс.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Технические характеристики датчика описаны следующим образом: одноэлементная сферическая чаша с диаметром апертуры 6 см и фокусным расстоянием 5 см и эллипсоидной фокальной зоной 4 мм в глубину и 0,8 мм в ширину в свободном поле.
   1. Погрузите сферический конус, преобразователь HIFU и крышку конуса в резервуар, наполненный дегазированной водой. Поместите преобразователь HIFU в сферический конус и закрепите крышку конуса в верхнем отверстии сферического конуса с помощью шести винтов с головкой (рис. 4B). После того, как пузырьки в сферическом конусе выводятся естественным путем из-за низкой плотности пузырьков по сравнению с водой, запечатайте переднее отверстие конуса прозрачной лентой толщиной 0,03 мм. Прикрутите компонент III к сферическому конусу.
   2. Извлеките преобразователь HIFU со сферическим конусом и компонентом III из резервуара для дегазированной воды.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Вода обратного осмоса (RO), используемая в исследовании, представляет собой воду, очищенную в процессе обратного осмоса. Вода обратного осмоса кипятится для удаления газа. После охлаждения дегазированная вода получается в индивидуальной герметичной емкости.
5. Осторожно поместите компонент I в пространство между нервом и мышцей и расположите нерв в промежутке компонента I. Выполните шаги 1.2.3 и 1.2.4, чтобы убедиться, что нерв находится внутри фокальной зоны HIFU (рисунок 2A).
6. Соедините функциональный генератор и радиочастотный усилитель мощности. Подключите усилитель мощности к преобразователю HIFU для генерации луча HIFU. Вручную установите выходное напряжение функционального генератора на преобразователь HIFU через усилитель мощности. Вручную выключите генератор функций, как только время воздействия HIFU истечет. Наблюдайте за временем с помощью таймера.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Интенсивность и энергия пучка HIFU, используемого в этом исследовании, составляют 2 810 Вт/^см2 и 84 Дж/^мм2 соответственно.
7. Одновременно с этим необходимо доставить стимул через систему электрофизиологического сбора данных (шаг 1.3) и пучок HIFU через систему HIFU (шаг 1.6) к седалищному нерву при одновременной регистрации CMAP. Постепенно увеличивайте воздействие HIFU на седалищный нерв с 3 с, 5 с до 8 с до тех пор, пока не будет наблюдаться снижение или ингибирование амплитуды CMAPs.
   1. Записывайте CMAP один раз в секунду во время доставки луча HIFU. После наблюдения за изменением амплитуды CMAP выключите систему HIFU и вручную нажмите на значок записи в программном обеспечении для сбора данных электрофизиологии, чтобы записывать CMAP каждые 2 минуты в первые 10 минут, каждые 5 минут в течение последующих 30 минут и каждые 10 минут в последней фазе, пока время записи не достигнет 2 часов.
8. Отделите компоненты II и III фиксатора нерва (рис. 2) для удаления датчика HIFU из места разреза. Разделите компоненты II и I, чтобы освободить защищенный седалищный нерв. Сшить операционное место крысы с диабетом 4-0 хромовыми кетгутовыми нитями после регистрации ХМАП. Нанесите жидкий йод на операционное место, чтобы предотвратить инфицирование.
   1. Поместите клетки на грелку и дайте крысам восстановиться в своих клетках, прежде чем возвращать их в помещение для животных. Обеспечьте крыс ибупрофеном в питьевой воде в течение 3 дней или внутрибрюшинным введением бупренорфина (0,05 - 0,1 мг/кг).
9. Вставьте стимулирующие и записывающие электроды в начало седалищного нерва и икроножных мышц крыс с диабетическим нейропатическим заболеванием, как описано в шагах 1.1.2 и 1.3, на 7, 14 и 28 день после первоначального ультразвукового исследования HIFU.

Результаты

Рисунок 1: Экспериментальная установка для блокады нервной проводимости in vivo с помощью высокоинтенсивного сфокусированного ультразвука (HIFU). (A) Изготовленный на заказ акриловый сферический конус, заполненны...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Streptozotocin	Sigma	85882
Biopac MP36 система сбора	Biopac Systems, Inc.
HIFU преобразователь	Sonic Concepts	H108
Функциональный генератор	Agilent	33250A
Усилитель мощности	Электроника и инновации	1040L
Rats	Biolasco тайвань	Sprague-Dawley
Puralube ветеринарная мазь	Dechra
Isoflurane vaporizer	Parkland Scientific	V3000PS
Isoflurane	Аттане

данных