Трансплантация клеток-предшественников интернейронов в мозг детеныша мыши

Аннотация

Источник: Quattrocolo, G., et al. Гомохронная трансплантация предшественников интернейронов в мозг мышей в раннем постнатальном периоде. J. Vis. Exp. (2018)

В этом видео демонстрируется трансплантация клеток-предшественников интернейронов в мозг неонатальной мыши с использованием гомотопического или гетеротопического подхода. Процедура включает в себя обездвиживание щенка-реципиента, идентификацию целевой области мозга и введение суспензии клеток-предшественников, полученных от донорского щенка на той же стадии развития. После инъекции детеныша перекладывают на согревающую подушку для восстановления, что позволяет впоследствии оценить выживаемость и созревание донорских клеток.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными моделями, были рассмотрены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным советом JoVE.

1. Удаление мозга мыши P0-P2

1. Прямо перед началом процедуры заполните несколько чашек Петри охлажденной, карбоксигенированной сахарозой искусственной спинномозговой жидкостью (sACSF). Также заполните пробирку (пробирки) для сбора ~25 мл sACSF.
2. Оберните щенка после родов от 0 до 2 дней (P0-P2) в какую-нибудь парапленку или перчатку и положите его хорошо накрытым под лед. Установите таймер на 5 минут и запустите его. По истечении этого времени снимите щенка и проверьте, чтобы он не реагировал на щипывание задней лапы.
3. Обезглавьте щенка и соберите голову в чашку Петри, наполненную sACSF. Разрежьте кожу по средней линии, чтобы обнажить череп.
4. Найдите отверстие в черепе в задней части мозга/спинного мозга и вставьте один конец щипцов вдоль дорсальной части черепа. Осторожно возьмитесь за череп по средней линии и «отклеивайте» куски сбоку, чтобы обнажить мозг, стараясь не повредить мозг.
5. После удаления тыльной и боковой частей черепа используйте щипцы или шпатель, чтобы аккуратно удалить мозг из черепа, зачерпывая под вентральную поверхность мозга, стараясь не повредить ни одну область. Поместите мозг в другую чашку Петри, наполненную карбоксигенированным sACSF. заметка: Мы представляем две различные стратегии рассечения гиппокампа, стриатума и коры головного мозга. Первая стратегия (шаги 2.1-2.10) полезна для любой линии мыши, тогда как вторая стратегия (шаги 3.1-3.7) потребует использования флуоресцентной мыши-репортера, чтобы четко отделить стриатум от бледного шара и других структур мозга. Если стриатум нежелателен, то игнорируйте специфичные для стриатума части этих двух методов

2. Соберите стриатум, гиппокамп и кору головного мозга, Техника #1

1. Поместите весь мозг на форму для разреза матрицы вентральной стороной вверх. Проведите 1 лезвие бритвы через самую переднюю часть мозга (через передний обонятельный тракт).
2. Вставьте еще одно лезвие бритвы прямо позади первого, чтобы получить срез 0,5 мм, и поместите дополнительное лезвие бритвы позади этого.
3. Переложите эти ломтики в чашку Петри с карбоксигенированным sACSF и поместите остальную часть мозга в отдельную чашку с sACSF. Перенесите стриатальные срезы в рассекающий эндоскоп, чтобы визуализировать стриатум. Эти срезы должны содержать большие участки переднего стриатума и не иметь гиппокампа. Используйте флуоресцентный препарирующий эндоскоп с Nkx2.1-Cre^+/-; Ai9^+/- срезы для дифференциации слабого полосатого сигнала tdTomato от сильного сигнала tdTomato бледного шара.
4. С флуоресценцией или без нее выдавите полосатое тело с обоих полушарий на всех срезах и перенесите полосатые фрагменты в правильно помеченную 50 мл пробирку с sACSF, храните на льду.
5. Гемисект мозга по средней линии с помощью щипцов или бритвенного лезвия и уложите полушарие так, чтобы медиальная поверхность была обращена вверх.
6. Удалите вентральную ткань мозга (таламус, базальные ганглии и т.д.), отщипнув эту ткань щипцами. Когда все будет готово, гиппокамп (структура в форме колбасы, охватывающая переднезаднюю ось вдоль дорсальной коры) и желудочковая сторона коры должны быть хорошо видны.
7. Чтобы удалить гиппокамп, введите кончики щипцов перед передним гиппокампом и аккуратно отделите гиппокамп от коры, перемещая щипцы кзади и сжимая вдоль гиппокампально-кортикальной границы. Перенесите изолированный гиппокамп в правильно помеченную 50 мл пробирку с sACSF, храните на льду.
8. Чтобы расчленить кору, поместите полусектированную кору медиальной стороной вниз. Затем используйте щипцы, чтобы ущипнуть самую дорсальную, вентральную, переднюю и заднюю части коры, чтобы оставить квадратный кусок медиальной соматосенсорной коры, ~2 мм x 2 мм. Переверните кору головного мозга так, чтобы медиальная сторона была вверх, и при необходимости очистите ее от любой избыточной некортикальной ткани (таламус, базальные ганглии и т. д.) на медиальной поверхности. Перенесите кусок коры головного мозга в правильно помеченную пробирку объемом 50 мл с sACSF, храните на льду.
9. Повторите процедуру с другим полушарием, чтобы собрать участки гиппокампа и коры головного мозга.
10. Повторите эту процедуру для всех щенков, обязательно заменяя sACSF в чашках Петри между щенками, чтобы убедиться, что sACSF остается холодным и свежим.

3. Соберите стриатум, гиппокамп и кору головного мозга, Техника #2

1. Поместите вентральную сторону мозга вниз в покрытую силгардом чашку Петри, содержащую sACSF, и проведите ее через мозжечок и переднюю кору или обонятельные луковицы.
2. Начиная с одного полушария, используйте изогнутые щипцы, чтобы аккуратно отделить заднюю кору головного мозга от нижележащего гиппокампа и других тканей. Аккуратно положите очищенную кору плашмя на чашку Петри. Повторите то же самое для другого полушария. Гиппокамп и полосатое тело должны быть хорошо видны в открытом мозге.
3. С помощью щипцов защемите один гиппокамп по средней линии и отшлифуйте гиппокамп сбоку для удаления. Поместите в коллекционный флакон на лед и повторите с другим гиппокампом.
4. Для стриатума аккуратно соскребите по краям стриатума, чтобы освободить его от окружающих тканей. Затем удалите полосатое тело, отщипнув его снизу, и добавьте его в пробирку для сбора льда. Повторите то же самое для другого полосатого тела.
5. Корковые срезы могут быть собраны, как описано в шаге 2.8.
6. При использовании трансгенной репортерной линии мыши (например, Nkx2.1-Cre; Ai9, Lhx6-GFP и т.д.), переносят стриатум в чашку Петри с sACSF и рассматривают под флуоресцентным препарирующим эндоскопом. Используйте щипцы для удаления любых неполосатых тканей из стриатума (в Nkx2.1-Cre; Ai9 мыши, удаляют всю «светлую» ткань, так как globus pallidus имеет гораздо более высокую медиальную ганглионарную выпуклость или MGE-производную, плотность клеток tdTomato+ по сравнению со стриатумом). Повторите для всех полосатых тел.
7. Повторите эту процедуру для всех щенков, обязательно заменяя sACSF в чашках Петри между щенками, чтобы убедиться, что sACSF остается холодным и свежим.

4. Генерация диссоциации одиночных клеток

1. После завершения диссекции приготовьте раствор проназы 1 мг/мл, взвешивая 10 мг проназы и растворяя в 10 мл карбоксигенированной sACSF.
2. Переложите салфетку из флаконов для сбора объемом 50 мл в пробирки с круглым дном объемом 5 мл, содержащие 2 мл раствора Pronase-sACSF. Инкубируйте ткань в течение 20 минут при комнатной температуре, встряхивая/щелкая пробирку пальцем 3-4 раза во время инкубации, чтобы перемешать образцы.
3. Во время этой инкубации приготовьте раствор Reconstitution: 1% фетальная бычья сыворотка (FBS, 100 μл) + ДНКаза (1 μЛ 1:10 000 стоковой ДНКазы) в 10 мл карбоксигенированной sACSF.
4. Через 20 минут осторожно удалите раствор проназы, чтобы не повредить ткань на дне, и замените его 1-2 мл раствора Reconstitution (общий объем зависит от исходного количества ткани).
5. Механически диссоциируйте ткань, растирая ткань с помощью предварительно подготовленных пипеток Пастера, отполированных огнем. Начиная с пипетки с большим отверстием (~600 мкм), аспирируйте и выдавите тканевый раствор не менее десяти раз, чтобы разрушить ткань. Не вводите в раствор пузырьки. Повторите этот процесс для пипетки среднего и малого диаметров. Раствор должен быть мутным, а в пробирках для сбора не должно быть видно ни одного прозрачного кусочка ткани.
6. Пипетируйте раствор клеточного лизата через фильтр 50 мкм в конические пробирки объемом 5 мл, чтобы удалить любые клеточные комки. Приступайте с помощью этих растворов для одиночных клеток к проточной цитометрии (или, возможно, непосредственно к подсчету клеток, если сортировка не требуется).

5. Приготовление очищенных от флуоресценции сортировкой клеток (FACS) клеточных растворов для трансплантации

1. После получения клеточных растворов из проточного цитометра переложите раствор в одну (или несколько) конических пробирок объемом 1,5 мл и вращайте клетки при 500 g в течение 5 мин при 4^°C. После центрифугирования удалите среду так, чтобы в пробирке осталось ~20-40 μл. Восстановите клетки в этой оставшейся среде (и объедините раствор, если требуется несколько пробирок).
2. На небольшом кусочке парапленки смешайте 2 мкл клеточного раствора + 8 мкл sACSF + 10 мкл трипанового синего красителя. Пипетируйте 10 μл в гемоцитометр со скользящей крышкой.
3. Подсчитайте количество живых клеток в каждой из квадратных сеток 4 x 4 в углах гемоцитометра с помощью стандартного лабораторного ручного счетчика (мертвые клетки будут синими от красителя) и усредните эти 4 счета. Умножьте это число на 100, чтобы определить количество клеток на мкл.
4. При необходимости отрегулируйте объем так, чтобы концентрация клеток составляла 10 000-30 000 клеток/мкл в растворе Reconstitution. Конечная концентрация зависит от общего количества клеток и желаемого количества трансплантаций. Держите клетки на льду для трансплантации

6. Пересадка в P0-2 WT

1. Заверните щенка дикого типа (WT) в парапленку или перчатку и положите его хорошо накрытым под лед. Установите таймер на 5 минут и запустите его. По истечении этого времени снимите щенка и проверьте, чтобы он не реагировал на щипывание задней лапы.
2. Пока щенок находится на льду, перемешайте клеточный раствор, пипетируя его несколько раз, чтобы убедиться, что клеточная суспензия хорошо перемешана перед загрузкой (перемешивайте клетки перед загрузкой микропипетки при каждой инъекции). Затем опорожните микропипетку от минерального масла и полностью заполните ее клеточной суспензией.
3. Поместите обезболенного щенка на чашку Петри так, чтобы его голова лежала на клеевой замазке так, чтобы макушка головы была относительно ровной. Наденьте ленту с алмазным отверстием на голову щенка, натянув его туго, чтобы убедиться, что кожа натянута, а голова твердая, но мышь чувствует себя комфортно и хорошо дышит. Лямбда должна быть видна через алмазное отверстие.
4. Переместите закрепленного щенка под нанопроект и опустите микропипетку так, чтобы кончик микропипетки находился прямо над лямбдой. Запишите координаты x-y на манипулятор.
5. Отрегулируйте ручки манипулятора для перемещения микропипетки в нужные координаты по медиолатеральной и переднезадней оси головы: первичная соматосенсорная кора или кора S1 → 1,0 мм спереди и 1,0 мм латерально, гиппокамп → 0,75-1,0 мм спереди и 1,0-1,2 мм латерально, стриатум → 2,0-2,2 мм спереди и 1,5 мм латерально. Координаты могут быть немного скорректированы, чтобы компенсировать возраст щенка (например, P0 против P2) или штамм мышей (например, мыши CD1 крупнее и C57/B6 в точке P2).
6. Опускайте микропипетку до тех пор, пока она не образует на коже небольшую вогнутость. Затем сильно, но осторожно поверните ручку манипулятора оси Z, чтобы провести микропипетку через кожу и череп и попасть в мозг. Когда микропипетка попадет в мозг, давление на череп будет ослаблено, и вогнутость исчезнет.
7. Слегка втяните микропипетку, пока кончик не будет окружен конусом кожи в форме палатки. Прочтите координаты вдоль оси z: это будет нулевая точка по оси z.
8. Опустите микропипетку на желаемую глубину: кора → 0,75-1,0 мм, гиппокамп → 1,2-1,5 мм, стриатум → 2,0-2,5 мм. Глубину можно немного отрегулировать, чтобы компенсировать возраст или напряжение щенка.
9. Введите клеточную суспензию с помощью описанной выше программы Nanoject III. После завершения программы инъекции подождите 15-20 секунд, прежде чем медленно втягивать микропипетку, чтобы свести к минимуму утечку раствора из места инъекции.
10. При выполнении двусторонних инъекций обнулите микропипетку над лямбдой и переместитесь в соответствующие координаты в другом полушарии. В качестве альтернативы можно сделать две инъекции в кору головного мозга одного и того же полушария, переместив микропипетку на 1 мм впереди первой инъекции.
11. После завершения трансплантации снимите ленту и переложите щенка на грелку. При необходимости пометьте щенка по обрезке хвоста или пальца ноги. Как только щенок вновь приобретет красный цвет и начнет двигаться, поместите его обратно в клетку вместе с матерью.

Материалы