Электропорация-опосредованная трансфекция ганглиев дорсальных корешков мыши для стимуляции регенерации сенсорных аксонов

Аннотация

Источник: Li, Q. et al. Исследование регенерации аксонов млекопитающих: электропорация in vivo ганглия заднего корешка взрослой мыши. J. Vis. Exp. (2018)

В этом видео демонстрируется электропорационно-опосредованная трансфекция нейронов DRG мыши для изучения регенерации аксонов. В нем описаны этапы доставки конструкций нуклеиновых кислот к нейронам DRG, индуцирования повреждения седалищного нерва и оценки регенерации аксонов.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными моделями, были рассмотрены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным советом JoVE.

1. Инъекция ганглия заднего корешка (DRG) Injection
   1. Введите раствор анестетика (разведите авертин в стерильном физиологическом растворе в конечной концентрации 20 мг/мл, с авертином 200 мг/кг массы тела) внутрибрюшинно, чтобы сохранить анестезию перед инъекцией DRG.
   2. Загрузите плазмиды дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) или олигонуклеиновую кислоту (РНК) (1 мкл на DRG) в стеклянную капиллярную пипетку.
   3. Осторожно вставьте кончик пипетки из капиллярного стекла в DRG.
   4. Постепенно вводите 1,0 мкл раствора ДНК-плазмид или РНК-олигонов в ДРГ с помощью внутриклеточных систем дозирования микроинъекций (30 psi, 8 мс).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Продолжительность инъекции должна составлять не менее 5 минут.
2. Electroporation
   1. Капните фосфатно-солевой буфер (PBS) на кончики электродов.
   2. Очистите кровотечение стерилизованной квадратной ватной марлей.
   3. Аккуратно зажмите целевую ДРГ электродами и подайте 5 квадратных электрических импульсов с помощью системы электропорации.
   4. Закройте мышечный и кожный слои капроновыми нитями 5-0 соответственно.
   5. Положите мышь на подогретое одеяло (35,0 °C) под пристальным вниманием, пока она полностью не придет в сознание, достаточное для поддержания лежачего положения на грудине. Верните мышь в домашнюю клетку после того, как она полностью оправится от анестезии.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Мыши требуется примерно 60 минут, чтобы полностью восстановиться после анестезии на одеяле при температуре 37 °C. Растворите одну таблетку (200 мг) ибупрофена в 1000 мл воды (0,2 мг/мл) для ежедневного кормления, чтобы облегчить послеоперационную боль.
3. Sciatic Nerve Crush
   1. Через два или три дня (в зависимости от экспериментального плана) после электропорации DRG обезболите мышь внутрибрюшинным раствором анестетика (с авертином 400 мг/кг массы тела).
   2. Прикрепите четыре конечности мыши к пробковой доске.
   3. Сделайте надрез на 1 см в 0,5 см в левую сторону по средней линии. Разрежьте мышцы, такие как большая ягодичная мышца и грушевидная мышца, в продольном направлении. Обнажите сегмент седалищного нерва между большим седалищным отверстием и седалищной выемкой.
   4. Раздавите нерв микрохирургическими щипцами в течение 12 с и отметьте место раздавливания нейлоновым эпиневральным швом 10-0. Сделайте узел на дюральной мембране, чтобы отметить место раздавливания.
   5. Закройте мышечные и кожные слои нейлоновым швом 5-0
   .
   6. Поместите мышь на подогретое одеяло (35,0 °C) с пристальным вниманием, пока она полностью не придет в сознание, достаточное для поддержания лежачего положения на грудине. Верните мышь в домашнюю клетку после того, как она полностью оправится от анестезии.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Мышь полностью восстанавливается после анестезии на одеяле при температуре 37 °C, требуется около 60 минут. Растворите одну таблетку (200 мг) ибупрофена в 1000 мл воды (0,2 мг/мл) для ежедневного кормления, чтобы облегчить послеоперационную боль.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
ECM 830 Система электропорации прямоугольной фазы	BTX Harvard Apparatus	45-0052	Для электропорации in vivo
Электроды Tweezertrodes Электроды	BTX Harvard Apparatus	45-0524	Для электропорации in vivo, плоский
1 ммPicospritzer III	Parker Instrumentation	1096	Внутриклеточные системы дозирования микроинъекций
Капилляры боросиликатного стекла	World Precision Instruments, Inc.
Стерео диссекционный микроскоп	Leica	M80
Микрохирургический щипцы	FST от DUMONT, Швейцария	11255-20	Только для раздавливания седалищного нерва
Glass Capillary	World Precision Instruments, Inc.	TW100-4	10 см, стандартная настенная
лента	Fisherbrand	15-901-30	Для крепления мыши на пробковой доске
2, 2, 2-Трибромэтанол (Авертин)	Sigma-Aldrich	T48402	Авертин стоковый раствор
2-метил-2-бутанол	Сигма-Олдрич	152463	Авертин стоковый раствор
миРНК Флуоресцентный универсальный негативный контроль #1	Сигма-Олдрич	SIC003	Нецелевая мимиРНК с флуоресцентной
микроРНК Контроль трансфекции с Dy547	Dharmacon	CP-004500-01-05	Нецелевая микроРНК с флуоресценцией
Набор для подготовки плазмид	Invitrogen Purelink	K210016	GFP-кодирующий плазмидный препарат
Fast Green	Dye Millipore-Sigma	F7252	Для лучшей визуализации контура DRG во время инъекции
Кетамин	Putney, Inc	NDC 26637-731-51	Индукция анестезии
Ксилазин	AnaSed	NDC 59399-110-20	Индукция анестезии
Ацетаминофен	McNeil Consumer Healthcare	NDC 50580-449-36	Послеоперационное обезболивание

1902328