Интратекальная доставка вирусов в мышиной модели для лечения заболеваний центральной нервной системы

Аннотация

Источник: Li, D., et al. Прямое интратекальное введение рекомбинантных аденоассоциированных вирусов взрослым мышам. J. Vis. Exp. (2019)

В этом видео показана процедура интратекального введения аденоассоциированных вирусов (AAV) в спинномозговую жидкость (ликвор) бодрствующей мыши, охватывающая подготовку шприца, выравнивание позвоночника и точное введение иглы. Этот метод проверяет целевую доставку генов, подтверждая ее потенциал для лечения ЦНС.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными моделями, были рассмотрены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным советом JoVE.

1. Приготовление 20% раствора лидокаина гидрохлорида

массой

1. 2 г лидокаина гидрохлорида. Добавьте 5–6 мл стерильной воды и осторожно перемешайте. Увеличьте объем до 10 мл стерильной водой.
2. 1.2 Отфильтровать исходный раствор через фильтры 0,2 микрона. Аквотируйте исходный раствор, 1 мл на 1,5 мл микроцентрифужной пробирки, и запечатайте ее герметизирующей пленкой. Хранить при температуре 4 °C.

2. Прямая интратекальная доставка AAV у бодрствующих мышей

1. Протрите рабочую зону стерильной марлей с 70% этанолом и подготовьте необходимые материалы.
2. Приготовьте 100 мкл комплекса AAVrh.10/1% лидокаина гидрохлорида, добавив 95 мкл стокового раствора rAAVrh10 (5 x 10¹² копий генома/мл) в стерильную микроцентрифужную пробирку объемом 200 мкл, и добавьте 5 мкл 20% раствора лидокаина гидрохлорида. Хорошо перемешайте, пипетируя вверх и вниз. Затем храните раствор вируса на льду (4 °C).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Будет использоваться 8 μL на мышь.
3. Подготовка шприца с раствором AAV для инъекций
   1. Соберите шприц Hamilton объемом 25 мкл с иглой 27 G и совместите скошенный кончик иглы с объемной шкалой на шприце
   .
   2. Аккуратно наберите в шприц 8 мкл с 4 x^{10 копиями 10} генома вирусного раствора. Обязательно удалите пузырьки воздуха.
4. Подготовка мыши
   ПРИМЕЧАНИЕ: В этом исследовании использовались самцы или самки мышей FVB/NJ (в возрасте 30–70 дней). В капот был выполнен IT-впрыск.
   1. Стерилизуйте рабочую зону в вытяжке с 70% этанолом. Положите бодрствующую мышь (самца или самку, возраст 30–70 дней, вес 13–20 г) на постельное белье в положении лежа на капюшоне. Накройте верхнюю часть туловища стерильной марлей, чтобы успокоить мышь и избежать укусов.
   2. Зафиксируйте животное, правильно и крепко взяв его за тазовый пояс большим пальцем с одной стороны и указательным/средним пальцем с другой стороны. Держите кожу между двусторонним тазовым поясом натянутой большим и указательным пальцами. Аккуратно держите ладонью верхнюю часть туловища животного.
   3. Выбрейте шерсть на спине между двусторонним тазовым поясом, затем простерилизуйте поверхность кожи скрабом на основе йода и 70% этанолом.
5. Intrathecal Injection
   1. Почувствуйте межпозвоночное пространство вдоль средней линии между двусторонними тазовыми поясами большим или указательным пальцем другой руки и нажмите на углубление ногтем, чтобы обозначить межпозвоночное пространство L5-L6 (найдите место инъекции).
   2. Слегка и осторожно поверните основание хвоста, чтобы обозначить среднюю линию позвоночника. Перед инъекцией отрегулируйте скос иглы по направлению к голове животного.
   3. Убедитесь, что животные закреплены прочно, и выровняйте иглу по средней линии позвоночника.
   4. Введите иглу аккуратно и вертикально (или слегка наклоните на 70–80°) в пересечении углубления, удерживая шприц в центральной сагиттальной плоскости. Медленно уменьшите угол примерно до 30°, когда он соединяет кость, затем вставьте иглу в межпозвоночное пространство.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Явное внезапное взмахивание хвостом является признаком успешного входа во внутридуральное пространство. Как только игла войдет в межпозвоночное пространство, кончик иглы будет ощущаться прочно зажатым. Игла 27 G, используемая в этом исследовании, подходит для введения ИТ мышам, но не крысам.
   5. Введите векторный раствор. Запустите таймер и введите 8 μL векторного раствора со скоростью 1 μL/4 с. Удерживайте иглу примерно в течение 1 минуты после окончания родов. Извлекайте иглу с осторожным вращением, чтобы избежать протекания.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
FVB/NJ мыши	Charles River Laboratories China
Lidocaine hydrochloride monohydrate	HEOWNS	73-78-9
AAV	Viral Vector Core of the Gene Therapy Center at University of Массачусетская медицинская школа
25 мкл шприц Hamilton/игла 27-30 г GASTIGHT		1702
70% этанол	WEN ZHI
Gauze Wei	AN	5171112	8 см * 10 см * 12 см