Субретинальное введение вирусных векторов в пигментный эпителий сетчатки на мышиной модели

Аннотация

Источник: Park, S. W., et al. Лимбальный подход - субретинальная инъекция вирусных векторов для генной терапии пигментного эпителия сетчатки мышей. J. Vis. Exp. (2015)

В видеоролике описан метод субретинального введения вирусных векторов в пигментный эпителий сетчатки (РПЭ) на мышиной модели. В нем подробно описана процедура от анестезии и подготовки глаза до точной доставки лентивирусного вектора, обеспечивающего интеграцию и экспрессию генов в РПЭ.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными моделями, были рассмотрены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным советом JoVE.

1. Подготовка набора для инъекций и вирусных векторов

1. Подготовьте микролитровый шприц, оснащенный тупой иглой 33 г, стерилизованный с использованием газообразного этиленоксида. Разбавьте вирусные векторы в PBS (фосфатно-солевой буфер) для получения адекватного титра в микропробирке (т.е. 1 x 10⁶ TU/μl). Промойте шприц несколько раз вирусными векторами, чтобы удалить все мертвые зоны в шприце.

2. Субретинальная инъекция вирусных векторов

1. Обезболите взрослых мышей (т.е. в возрасте от 6 до 8 недель) с помощью внутрибрюшинной инъекции смеси тилетамина и золазепама (1:1, 2,25 мг/кг массы тела) и ксилазина гидрохлорида (0,7 мг/кг массы тела) или альтернативной подходящей схемы анестезии.
2. Расширяют зрачки глазными каплями фенилэфрина 0,5% и тропикамида 0,5%.
3. Приготовьте микролитровый шприц, загрузив в него 1,5 - 2 мкл вирусных векторов.
4. Откройте веко и выпячивайте глаз, чтобы обнажить экватор для удобного введения. Сосредоточьтесь на нем под операционным микроскопом. Сохраняйте положение выпяченного глаза до окончания инъекции, иначе во время инъекции может произойти смещение иглы. Чтобы надежно удерживать глазное яблоко, поместите пальцы за пределы орбитального ободка.
5. Нанесите каплю офтальмологического вязкоэластичного раствора на поверхность роговицы.
6. Поместите небольшую круглую покровную горку на верхнюю часть роговицы, чтобы визуализировать сетчатку.
7. Проколите небольшое отверстие немного позади лимба с помощью стерильной иглы 30 G 1/2 для дальнейшей субретинальной инъекции. Для удобства сделайте отверстие нижним для правого глаза и верхним для левого глаза.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если отверстие сделано в височной или носовой области, после инъекции будет трудно прикрыть веко. Первоначальный прокол должен быть сделан немного позади лимба, чтобы избежать лимбальных сосудов, которые проходят вдоль лимба и могут быть легко распознаны. Будьте осторожны, чтобы не задеть линзу иглой во время первоначального прокола. Не вставляйте весь скос иглы, чтобы избежать прокола линзы.
8. Поместите тупую иглу 33 G микролитрового шприца через предварительно проколотое отверстие и приближайтесь к игле в субретинальное пространство до тех пор, пока не почувствуете легкое сопротивление.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для субретинальной инъекции наилучший угол подхода иглы составляет около 45 градусов по отношению к плоскости радужной оболочки, и тупая игла должна быть протолкнута назад к перипапиллярной области. Пунктирный квадрат указывает предполагаемый путь иглы через полость стекловидного тела для субретинальной инъекции на рисунке 1.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При прокалывании (или прохождении) слоев сетчатки сопротивление ощущаться не будет, так как они очень мягкие. Таким образом, первое ощущение легкого сопротивления указывает на то, что игла уже коснулась слоя РПЭ (пигментного эпителия сетчатки), и введение иглы следует прекратить. Будьте осторожны, чтобы не проникнуть в склеральную ткань с чрезмерным давлением, потому что игла должна быть размещена в потенциальном субретинальном пространстве. Если игла прокалывает склеральную ткань чрезмерной силой, она без сопротивления попадает во внеглазные орбитальные пространства. (Этот шаг имеет решающее значение)
9. Введите вирусные векторы (например, 1 x 10⁶ TU/μl) осторожно в субретинальное пространство без тремора, чтобы избежать нежелательного повреждения тканей. Затем осторожно извлеките иглу. Крепко удерживайте глазное яблоко во время инъекции, как описано в пункте 2.4.
10. Наблюдайте за формированием субретинальных пузырьков после инъекции под операционным микроскопом, чтобы убедиться в отсутствии кровотечения из сетчатки.

Результаты

Рисунок 1. Принципиальная схема субретинальной инъекции. H&E (окрашивание гематоксилином и эозином) окрашивало поперечное сечение глаза мыши, изображающее структуры с игольчатым путем для субретинальной инъекции, отмеченным пунктирным кв...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Пинцет DUMONT #5 11см DUMOSTAR 0,1 x 0,06 мм наконечники	WPI	500233
VANNAS Ножницы S/S, 105 мм	WPI	555583S
33G Тупой иголец	WPI	NF33BL-2
Шприц NanoFil, 10 микролитров	WPI	NANOFIL
RPE-KIT	WPI	RPE-KIT	Для легкого введения одной рукой
30Gx1/2 (0,3 мм x 13 мм) BD PrecisionGlideTM Игла	BD	305107	Начальный прокол для субретинальной инъекции
Защитные очки для микроскопа (No 1 диаметр 3 мм)	Warner Instruments	64-0720 (CS-3R)
Leica операционная микроскоп	Leica	LM M80
Fluoresecein микроскоп	Nikon	Eclipse 80i
Lentivirus	Thermo scientific	TMO. LV-Ctr	Используется для разбавления векторов
PBS	Gibco	10010-015	Используется для разведения векторов
Троперин (фенилэфрин 0,5%-тропикамид 0,5%)	Hanmi		Для дилатации
Пропаракаина гидрохлорид Офтальмологический раствор USP, 0,5% (стерильный)	Bausch&Lomb		Для местной анестезии
Healon GV OVD	Abbott Medical Optics Inc.
Золетил 50 (тилетамин гипохлорид и золазепам гипохлорид)	Вирбак		Для общей анестезии
Ромпун® инъекции (Ксилазин гидрохлорид	Байер		Для общей анестезии

)