Метод инфракрасной спектроскопии с преобразованием Фурье для изучения самосборки пептидов

Аннотация

Источник: Neves, R., et al. Синтез и характеристика 1,2-дитиолановых модифицированных самоорганизующихся пептидов. J. Vis. Exp. (2018)

Это видео демонстрирует самосборку амилоидных пептидов в богатую бета-листами супрамолекулярную структуру с помощью инфракрасной спектроскопии с преобразованием Фурье. Инфракрасный луч пропускается через кристалл с высоким показателем преломления, и регистрируется поглощение энергии на границе кристалла и образца. Вторичные структуры белков образца идентифицируются путем анализа их характерных пиков поглощения в определенных областях инфракрасного спектра, что помогает идентифицировать формирование супрамолекулярной сборки.

Протокол

1. Характеристика супрамолекулярных самоорганизующихся структур

1. Образование амилоидных волокон
   1. Чтобы приготовить раствор для самосборки, взвесьте 1 мг пептидного порошка с помощью аналитических весов. Растворите в смеси (pH 7,5) 20% ацетонитрила и 10 мМ (4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазитансульфоновой кислоты (HEPES) в микроцентрифужной пробирке объемом 1,5 мл до конечной концентрации пептидной сборочной смеси 1 мг/мл. Вонзите раствор для сборки и оставьте его собирать при комнатной температуре.
2. Спектроскопическая характеристика амилоидных волокон
   1. Отслеживайте процесс сборки пептидов с помощью инфракрасной спектроскопии с преобразованием Фурье каждые несколько дней. Широкий пик с центром около 1670 ^см-1 представляет собой ИК-сигнатуру, возникающую из разобранных пептидов в образце. Образцам пептидной сборки обычно требуется одна-две недели, чтобы широкий несобранный пик исчез и достиг зрелости.
      1. Высушите аликвоту 8-10 мкл сборочного раствора в виде тонкой пленки на кристалле алмаза ATR. Следите за исчезновением большого и широкого водного пика от 1640 до 1630 ^см-1 по мере образования сухой пленки.
      2. Получение ИК-спектров от 1500 до 1800 ^см-1 в среднем за 50 сканов с разрешением 2 ^см-1. Получение и вычитание фоновых сканов перед каждым сканированием образца. ИК-сигнатура для сборки из β листов представляет собой острый пик между 1625 и 1635 ^см-1 (рис. 1A).

Результаты

Рисунок 1. Супрамолекулярная характеристика 1,2-дитиоланового модифицированного пептида. (a) ИК-Фурье 1,2-дитиолан-KLVFFAQ-NH₂ волокон 1 мг/мл, собранных в 10 мМ HEPES, pH 7,5 в 20% CH₃CN. Пик в 1627 ^см-1 согласуется с пептидами,...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Ацетонитрил	Fisher Scientific	A998-4	легковоспламеняющийся; раздражающий глаза; Использовать средства индивидуальной защиты; Использовать только под вытяжным шкафом; хранить вдали от открытого огня или горячей поверхности; при контакте промыть водой в течение не менее 15 минут и получить медицинскую помощь
4-(2-гидроксиэтил)пиперазин-1-этансульфоновая кислота	Acros Organics	AC172571000	Не вдыхать; использовать на открытом воздухе или в хорошо проветриваемом помещении
инфракрасный спектрометр с преобразованием	Фурье Альфа Тензор, Bruker