Микроинъекция мозга грызуна с помощью кварцевой микроиглы

Аннотация

Источник: Paolone, G., et al. Персонализированные иглы для микроинъекций в мозг грызуна. J. Vis. Exp. (2018).

В этом видео демонстрируется инъекция микроигл в мозг грызуна с помощью кварцевой микроиглы с отверстиями. Микроигла прикрепляется к шприцу и микронасосу для контроля скорости доставки. Игла с раствором для инъекций вводится в мозг при низкой скорости доставки. После позиционирования скорость доставки увеличивается. Игла извлекается после короткой паузы.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными моделями, были проверены местным комитетом по уходу за животными и ветеринарной экспертной комиссией JoVE.

1.

1. Очистите и простерилизуйте кварцевые капилляры (см. Таблицу материалов), поместив их на 5 минут в дистиллированную воду, на 5 минут в этанол 99% и на 5 минут в диэтиловый эфир.
2. Оставьте капилляры под колпаком не менее чем на 1 час, чтобы они полностью высохли.
3. Подготовьте иглы с помощью лазерного пуллера в соответствии с параметрами, позволяющими изготовить достаточно длинную, достаточно тонкую иглу, в зависимости от индивидуальных потребностей.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Мы используем лазерный пуллер (см. Таблицу материалов). Используйте двухстрочную программу для вытягивания. Первая линия использует высокую мощность, самую большую длину сканирования (соответствующую значению нити) и не имеет тягового усилия. Такое сочетание параметров приводит к плавлению самой большой части капилляра с наименьшей скоростью растяжения, что позволяет формировать длинную иглу с большим внутренним/внешним размером и уменьшенным хвостовиком. Таким образом, игла сохраняет высокую механическую прочность и широкий внутренний диаметр, что позволяет проходить стволовым клеткам или вирусным частицам без засорения. Скорость и задержка этой программной линии должны остановить растяжение капилляра до того, как наконечник станет слишком маленьким и длинным, упустив требуемые механические и формальные характеристики. Вторая строка программы вытягивания выполняется автоматически после того, как кварц остынет (5 с). Параметры мощности, нити и тягового усилия являются функциональными для резки наконечника с максимально короткой длиной наконечника и крутым хвостовиком, избегая разделения двух игл с разрывом кончика. Обычно с нашим оборудованием мы используем следующее: (a) Линия 1 = мощность 990, нить накала 5, скорость 130, задержка 110, тяга 0; (b) Линия 2 = мощность 970, нить накала 3, скорость 0, задержка 70, тяговое усилие 0.
4. Поместите иглы в чашку Петри, предварительно очищенную 70% этанолом.
   1. Накройте тарелку пластиковой парафиновой пленкой.
5. Разрежьте капилляры с помощью микродиссектора.
   1. При запуске позвольте лазеру запустить процесс автокалибровки для проверки мощности и энергии. Затем задаем параметры резки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Мы используем микродиссектор (см. Таблицу материалов) и следующие параметры: энергия импульса лазера (63 μДж), диаметр лазерного луча 20% от максимальной апертуры (максимальная апертура: 1,0 μм) и скорость резки 10% от максимальной скорости (максимальная скорость: 30 μм/с).
   2. Плотно закрепите иглу на столе микроскопа и расположите ее кончик в центре экрана компьютера.
   3. В строке меню нажмите на значок карандаша и с его помощью нарисуйте отметку для лазерной резки иглы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Разрез должен быть под углом около 45° по отношению к поверхности иглы.
   4. В функции боковой панели выберите флажок, содержащий кнопку «НАЧАТЬ РЕЗКУ», чтобы лазер мог вырезать ранее отмеченное пятно.
   5. При необходимости вырежьте боковое отверстие (отверстия), повторив процедуры, описанные в 1.5.2-3; нет необходимости изменять положение иглы (рис. 1).
6. Очистка после резки.
   1. Подключите иглу к пустотному насосу через пластиковую трубку.
   2. Включите насос и вручную установите скорость прямого потока на умеренной скорости (3 μл/мин).
   3. Сначала отсадите 99% этанол, а затем дистиллированную воду, чтобы удалить загрязнения, образовавшиеся в результате резки.
   4. Снова вдохните 99% этанол для облегчения высыхания.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый этап должен длиться не менее 3 минут.
7. Храните иглы в правильно закрытой чашке Петри до дня операции.
8. Иглы можно использовать повторно; в конце эксперимента очистите их отбеливателем и этанолом, чтобы удалить раствор и возможные остатки тканей. Для более полной очистки поместите иглы в банку для хранения микропипеток кончиком вниз, наполните банку дистиллированной водой до тех пор, пока кончики не будут покрыты, кипятите 1,5 минуты, чтобы удалить остатки ткани, затем промойте этанолом.

2. Процедура

1. Следуя инструкциям в руководстве пользователя насоса, выберите меню настроек для калибровки насоса в соответствии с диаметром/объемом шприца для микроинъекций и установите скорость потока на уровне 0,3 мкл/мин.
2. Наполните шприц объемом 10 мл, оснащенный тупой иглой (например, иглой Гамильтона, 30 г) и короткой политетрафторэтиленовой трубкой, стерильной водой и используйте ее для наполнения шприца для микроинъекций (после очень осторожного извлечения поршня) и комплекта деталей для узла инъекций ручного микроинъекционного насоса (MMP).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Комплект MMP используется для надежного крепления иглы в стереотаксической раме (Рисунок 2). В комплект входят политетрафторэтиленовая трубка, муфта люэр-трубка, держатель для пипеток, а также прокладки для пипеток с разным наружным диаметром.
3. Подсоедините иглу к набору MMP.
   1. Промойте больше воды через систему через шприц объемом 10 мл и проверьте, выходит ли вода из иглы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что вы удалили все пузырьки воздуха внутри системы, повторяя шаги заполнения.
4. Отсоедините шприц объемом 10 мл от шприца для микроинъекций, медленно нажимая на поршень, чтобы капля воды осталась в верхней части шприца для микроинъекций. Вставьте поршень в шприц для микроинъекций.
5. Подсоедините шприц для микроинъекций к насосу и установите скорость потока на уровне 0,3 мкл/мин.<бр />ПРИМЕЧАНИЕ: Подождите, пока капля не вытечет из кончика иглы, а затем дайте ей выйти еще на 3 минуты.
6. Установите расход на уровне 0,1 μл/мин и начните операционную процедуру. Насос должен работать во время проведения операции.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для экспериментов, описанных в этой статье, мы использовали самцов крыс Sprague Dawley весом 300 г (в возрасте 3 месяцев). Тем не менее, процедура применима и к другим видам, в частности к мышам.
7. Индуцируйте общую анестезию методом, одобренным местными правилами.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Мы используем смесь внутрибрюшинных инъекций (внутрибрюшинных инъекций) 85 мг/кг кетамина и 8 мг/кг ксилазина в течение 20-50 минут анестезии. Важно, чтобы для обеспечения полного успокоения животного использовались зажимы для хвоста и/или пальцев ног. Уровень анестезии и основные жизненно важные показатели оцениваются до начала операции и контролируются каждые 10 минут во время проведения операции. Температура тела животного поддерживается постоянной до, во время и после хирургических процедур с помощью грелки с рециркуляцией воды. За животными наблюдают до полного выздоровления (например, они находятся в вертикальном положении и передвигаются). Кроме того, животные получают анальгетики (трамадол, 5–7 мг/кг в/ч) после операции каждые 24 часа в течение трех дней.
   1. Побрейте голову животного и адекватно подготовьте место операции к асептической операции. Проведите двухэтапное скрабирование раствором на основе йода (бетадином) с последующим добавлением 70% этанола. Кроме того, для поддержания асептики оберните место операции хирургической простыней (в видео опущено в демонстрационных целях).
8. Поместите крысу в стереотаксическую рамку над нагревательным одеялом с рециркуляцией воды. Для дополнительного обезболивания, в месте хирургического вмешательства применяют 0,5% раствор лидокаина (не должны превышать 7 мг/кг). Предварительно простерилизуйте все хирургические инструменты с помощью стерилизатора с шариками или жидкой холодной дезинфекции путем погружения оборудования в 2% глутаральдегида плюс 7,05% фенола (спородицин или цидекс) с последующим промыванием стерильной водой или физиологическим раствором. Дезинфекцию необходимо проводить еще между процедурами. Сделайте продольный надрез над черепом с помощью стерилизованного скальпеля. Будьте осторожны, чтобы избежать чрезмерного кровотечения. Откройте кожу головы с помощью плоского шпателя и наложите хирургические зажимы на лоскуты кожи, чтобы она оставалась открытой. Очень аккуратно отсоедините надкостницу, чтобы обнажить брегму и область черепа, через которую будет вводиться игла.
9. Установите руку на стереотаксическую рамку (во время потока) и переместите кончик иглы точно на вершину брегмы, следя за тем, чтобы не сломать ее кончик. Аннотируйте передне-задние и медиолатеральные координаты брегмы и преобразуйте их в нужные координаты. Руководствуясь стереомикроскопом, опустите иглу до тех пор, пока ее кончик почти не коснется черепа, отметьте место сверления, предварительно немного приподняв стереотаксическую руку.
10. Сверлиль (наконечник сверла Ø: 0,8 мм; скорость сверления: 1 000 об/мин) череп на отмеченном месте. Необходимо соблюдать осторожность, чтобы не проникнуть в твердую мозговую оболочку во время процедур сверления. Во время сверления капайте стерильный физиологический раствор, чтобы избежать повреждения костей и некроза.
11. Отрежьте небольшой кусочек пластиковой парафиновой пленки и положите его на череп. С помощью пипетки объемом 10 мкл сделайте каплю раствора для введения на пластиковую парафиновую пленку. Остановите насос, слегка притяните толкатель насоса и создайте небольшой пузырь воздуха в капилляре, осторожно потянув за поршень шприца для микроинъекций.
12. Опустите стереотаксический рычаг до тех пор, пока кончик иглы не достигнет капли. Возьмите образец, потянув (очень медленно) за поршень шприца для микроинъекций, избегая образования пузырьков. Установите на место толкатель насоса, контактирующий с поршнем, и включите насос со скоростью расхода 0,3 μл/мин. Дождитесь образования капли (несколько минут), прежде чем переходить к следующему шагу.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В данном примере эксперимента искусственная спинномозговая жидкость (aCSF) вводилась в стриатум [AP (переднезадняя): +1,5, ML (медиолатеральная): ±2,7; DV (дорсовентральный): -5,0] и в дорсальном гиппокампе (AP: -3,5, ML: ±2,1; DV: -3.5; в мм от твердой мозговой оболочки), 2 μл/сайт. Чтобы облегчить сравнение между двумя методами инъекции, каждая область мозга вводилась с помощью кварцевой иглы в одном полушарии и тупого наконечника 26 G или иглы из нержавеющей стали со скошенным концом 30 G в другом.
13. Уменьшите расход до 0,1 мкл/мин, надрежьте твердую мозговую оболочку иглой со скосом из нержавеющей стали и медленно опустите стереотаксическое плечо на дорсо-вентральной оси, входя в ткани мозга. Когда желаемое положение будет достигнуто, опуститесь еще на 0,1 мм, остановите насос, поднимите стереотаксический рычаг на 0,1 мм и снова запустите насос при расходе до 0,3 мкл/мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Причина поддержания медленного потока при опускании иглы заключается в обеспечении положительного давления, которое предотвращает проникновение мелких фрагментов ткани в саму иглу. Такое событие может привести к закупорке наконечника, что нарушит доставку раствора. Поскольку скорость потока при опускании иглы очень низкая, а скорость опускания составляет около 10 с/мм, это означает, что количество раствора, остающееся вдоль траектории иглы, незначительно по сравнению с количеством раствора, вводимого в целевой участок. Этой меры предосторожности можно избежать при использовании игл с боковыми отверстиями.
14. Запустите таймер и подождите необходимое время в зависимости от желаемого объема для впрыска (например, 6 мин 40 с при впрыскивании 2 мкл). Следите за движением пузырьков во время инъекции. В конце остановите насос и подождите 5 минут, прежде чем медленно извлекать иглу. Когда кварцевая игла будет полностью извлечена, снова запустите насос и проверьте образование капли на кончике иглы.
15. Заклейте отверстие на поверхности черепа костным воском, снимите кровоостанавливающие зажимы и зашите кожу головы, обмажьте область вокруг раны кремом с антибиотиком (например, неоспорином) и верните животное в домашнюю клетку.

Результаты

Рисунок 1: Микроскопическое изображение наконечника кварцевой иглы, показывающее различные диаметры наконечника и отверстия, используемые для впрыска жидкостей. Изображение с малым увеличением в (A) и большим увеличением в (B) и (C). Игла може...

Материалы