Адресная доставка миРНК в нейроны для сайленсинга прионных белков с помощью липосомальных комплексов

Аннотация

Источник: Bender, H. R., et.al. Доставка терапевтических миРНК в ЦНС с помощью катионных и анионных липосом. J. Vis. Exp. (2016)

В этом видео демонстрируется адресная доставка миРНК прионного белка (PrP) к нейронам с помощью липосомальных миРНК-пептидных комплексов (LSPC). Катионные липосомы электростатически связываются с миРНК, нацеленной на PrP, которая в дальнейшем стабилизируется пептидом RVG-9r для рецептор-опосредованного транспорта через гематоэнцефалический барьер. Попадая внутрь мозга, LSPC подвергаются эндоцитозу в нейронах, высвобождая миРНК для инициирования РНК-интерференции, снижая экспрессию PrP и прерывая прогрессирование прионного заболевания.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными моделями, были рассмотрены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным советом JoVE.

1. Приготовление LSPC

1. Используйте соотношение холестерина 1:1 DOTAP (1,2-диолеоил-3-триметиламмоний-пропан): холестерин для LSPC. Для приготовления препарата липосома 4 нмоль смешайте 2 нмоля ДОТАП и 2 нмоля холестерина с 10 мл раствора хлороформа:метанола 1:1 в колбе.
2. Выпарить 9 мл раствора хлороформа:метанола, используя газ N₂ в вытяжном шкафу. Выпарить последний 1 мл растворителя в вытяжном шкафу в течение ночи без газа. Обратите внимание на тонкую липидную пленку на дне колбы.
3. Нагрейте 10 мл 10% раствора сахарозы до 55 °C.
4. Нагретый 10% раствор сахарозы вылить на тонкую липидную пленку медленно, т.е. 1 мл/мин, при этом аккуратно поворачивая колбу. Поддерживайте 10% сахарозу и колбу с липидами при температуре 55 °C, чтобы молекулы липидов оставались в гелево-жидкой фазе. Регидратация приводит к образованию многослойных везикул (MLV).
5. Дайте липидам регидратироваться при температуре 55 °C в течение как минимум одного часа перед измерением липосом.
6. Соберите экструдер в соответствии с инструкциями производителя с фильтрами 1,0 мкм или используйте шприцевые фильтры 1,0 мкм для определения размера.
7. Добавьте 1 мл подогретой липосомной суспензии в один из шприцев на экструдере и пропустите суспензию между двумя шприцами 11 раз. После 11 проходов убедитесь, что суспензия находится в шприце, противоположном исходному.
8. Снова измельчите липосомы с помощью фильтров 0,45 мкм, а затем 0,2 мкм, чтобы получить большие униламеллярные везикулы (LUV). Держите липосомальную суспензию в тепле для облегчения определения размера.
9. Инкубировать 20 мкл суспензии липосомы 4 нмоль (200 мкМ) с 200 мкл 20 мкМ (всего 4 нмоль) стокового раствора миРНК в течение 10 мин при комнатной температуре.
10. Инкубировать 80 мкл 500 мкМ (всего 40 нмоль) исходного раствора RVG-9r с раствором миРНК/липосома в течение 10 мин в режиме ЛТ. ЛСКК следует использовать как можно скорее, но можно использовать в течение нескольких часов после приготовления. Храните LSPC при температуре 4 °C в течение нескольких часов после приготовления.

2. Введение мышам LSPC

1. Подвергайте мышей в течение 5-10 минут воздействию тепловой лампы для расширения сосудистой сети.
2. Обезболивайте мышь 2-3% потоком изофторана/кислорода за 5-10 минут до инъекции и во время инъекции. Подтвердите обезболивание, когда животное больше не передвигается и дыхание замедлилось, сделав щиплет палец ноги. Положите мышь на заднюю или боковую сторону, чтобы получить доступ к хвостовой вене. Используйте ветеринарную мазь на глазах мыши, чтобы предотвратить высыхание во время анестезии.
3. Протрите/распылите на хвост 70% EtOH и введите 300 μл LSPC в хвостовую вену мыши с помощью инсулинового шприца 26 г. Начинайте делать инъекции дистально в хвостовую вену и двигайтесь проксимально, если вена лопнула или разорвалась.
4. Поместите мышь в чистую клетку до тех пор, пока она не перестанет лежать на грудине. Не помещайте мышь с другими соседями по клетке, пока она полностью не восстановится. Мыши должны восстановиться через 5-15 минут. Их можно разместить на грелке или под нагревательной лампой для поддержания температуры тела, если восстановление занимает больше времени. За мышами следует внимательно следить, чтобы защититься от перегрева.
5. Наблюдайте за животным в течение нескольких часов после инъекции, чтобы убедиться, что анестезия ослабевает и нет побочных эффектов лечения. Дайте LSPC циркулировать не менее 24 часов.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
DOTAP липиды	Avanti	890890
холестерин	Avanti липиды	700000
хлороформ	Fisher Scientific	AC268320010
метанол	EMD Millipore	113351
N₂ Gas AirGas
Sucrose	Fisher Scientific	S5-500
Экструдер	Avanti Lipids	610023
фильтрами 1,0, 0,4 и 0,2 мкм	Avanti Lipids	610010, 610007, 610006