$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Все процедуры, связанные с образцами животных, были рассмотрены и одобрены соответствующим комитетом по этической экспертизе животных.
1. Ki67 Анализ пролиферации
- клеток Ki67 Анализ пролиферации клеток Ki67 (иммуноцитохимия)
- Промойте клеточные культуры буфером 0,1 М фосфата (PO4) в течение одной минуты два раза. Зафиксируйте культуру с 4% параформальдегидом (PFA) в течение 20 мин при комнатной температуре. Удалите PFA и промойте лунки PBS в течение семи минут три раза.
- После заключительного промывания добавьте в каждую лунку по 100 мкл раствора блокатора (фосфатный буферный раствор, 5% нормальная сыворотка осла, 0,4% сыворотка бычьего альбумина и 0,2% Triton X-100) и инкубируйте при комнатной температуре в течение 1 ч. Приготовьте первичное антитело, анти-Ki67 кролика, разбавив его в растворе блокатора в рабочем соотношении 1:200.
- Удалите раствор блокатора и нанесите по 100 мкл раствора первичного антитела в каждую лунку. Накройте 96-луночный планшет и инкубируйте образцы при температуре 4 °C в течение ночи.
- На следующий день удалите раствор антител и промойте PBS в течение 7 минут 3 раза.
- Приготовьте вторичное антитело осла антикроличья Cy3 в блокирующем растворе в рабочем соотношении 1:500. Добавьте ядерный краситель DAPI в раствор вторичного антитела в разведении 1:100. После удаления последней промывки PBS нанесите по 100 мкл вторичного раствора антитела/DAPI в каждую лунку. Инкубировать при комнатной температуре в темноте в течение 90 мин.
- Удалите вторичный раствор антител/DAPI и промойте каждую лунку PBS в течение 7 мин, 3 раза. Накройте 96-луночный планшет и храните при температуре 4 °C до визуализации.
2. Автоматизированная визуализация и многоволновой скоринговый анализ
- Загрузите 96-луночный планшет (предварительно обработанный для иммуномаркировки Ki67) в систему HCS и дайте планшету уравновеситься в течение 20 мин. Откройте программное обеспечение для получения и анализа изображений системы HCS.
- Выберите настройки съемки для объектива 10X с помощью объединения камер в точке 1 и настройке усиления 2. Найдите Z-плоскость, в которой находятся клетки, с помощью функции «Автоэкспонирование» и рассчитайте смещение для каждой интересующей вас длины волны. Для этого анализа захватите изображения для DAPI (W1), Cy3 (W2). Выберите максимальный уровень интенсивности, при котором отрицательные контрольные лунки не показывают сигнал для получения изображения. Убедитесь, что этот параметр подходит для положительных скважин.
- Приобретите пластину. Захватывайте изображения и сохраняйте их в базе данных программного обеспечения для сбора и анализа изображений.
- После получения изображений откройте автономное программное обеспечение для получения и анализа изображений и просмотрите данные пластин по полученным выше изображениям.
- Выберите анализ оценки по нескольким длинам волн. Настройте минимальную и максимальную интенсивности для каждой длины волны.
ПРИМЕЧАНИЕ: Обнаружение DAPI должно отмечать окрашивание вокруг каждого видимого ядра. Cy3 должен обнаруживать положительные клетки с иммунореактивностью (ИР) Ki67 и не должен обнаруживать ИР при отрицательном контроле. Для Cy3 Ki67 IR приблизительная минимальная ширина составила 7 мкм, приблизительная максимальная ширина — 30 мкм, интенсивность над локальным фоном — 150 уровней серого, а минимальная площадь окрашивания — 50мкм2. - Запустите анализ для всех позиций. Экспортируйте данные для просмотра в таблице.