Резекция опухоли головного мозга у мышей с помощью малоинвазивной системы резекции

Аннотация

Источник: Alomari, S., et al. Проведение минимально инвазивной резекции опухоли головного мозга у грызунов для сбора тканей с высокой жизнеспособностью. J. Vis. Exp. (2022)

В этом видео демонстрируется использование минимально инвазивной системы резекции (MIRS) для иссечения опухолевой ткани у мыши, находящейся под наркозом, которой имплантировали опухоль. Процедура включает в себя закрепление мыши на стереотаксической раме, повторное открытие предыдущего хирургического места для доступа к мозгу и введение специализированной канюли, которая использует всасывание и вращающееся лезвие для удаления участков опухоли. После резекции иссеченная ткань собирается с помощью стерильной трубки, а рана закрывается для восстановления.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными моделями, были рассмотрены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным советом JoVE.

1. Первичная имплантация внутричерепной опухоли

1. На начальном этапе исследования внутричерепно вводят каждой мыши 100 000 клеток (клеточная линия мышиной глиомы GL261), суспензированных в 4 мкл фосфатно-солевого буфера (1x PBS) на глубину 2,5 мм в соответствии с ранее опубликованным отчетом.
2. Количественно оцените опухолевый сигнал у каждой мыши с помощью системы визуализации in vivo через 9 дней после имплантации опухоли.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости разделите мышей на две группы в зависимости от опухолевой нагрузки. В настоящем исследовании были представлены две группы: (1) мыши с относительно небольшой опухолевой нагрузкой (средний биолюминесцентный сигнал = 5,5e+006 ± 0,1e+006 фотонов/с, n = 10) и (2) мыши с относительно большой опухолевой нагрузкой (средний биолюминесцентный сигнал = 1,69e+007 ± 0,2e+007 фотонов/с, n = 10), (p < 0,05, критерий Манна-Уитни).
3. Разделите каждую группу на две сопоставимые подгруппы.
   >ПРИМЕЧАНИЕ: В этом исследовании две подгруппы были следующими: нелеченные мыши (n = 5) и мыши с опухолями, перенесшие хирургическую резекцию с использованием метода MIRS (n = 5), (p > 0,05, тест Манна-Уитни).
4. Начиная со дня резекции, отслеживайте прогрессирование опухоли с помощью системы визуализации in vivo с частотой, основанной на характере роста опухоли.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для клеточной линии GL261 отслеживайте прогрессирование опухоли в день резекции, а затем каждые 3-6 дней.

2. Резекция опухоли с использованием MIRS

1. Обезболивание мыши с использованием газовой смеси изофлурана-О2 в индукционной камере или внутрибрюшинного введения раствора ксилазина/кетамина.
   1. При использовании газового анестетика установите расход газа на 1,0 мл/мин, а испаритель на 2,0% для индукции анестезии, обычно требуется 3-5 минут в камере (см. Таблицу материалов).
   2. При использовании инъекционного анестетика обезболивайте мышей путем введения 0,2 мл раствора анестетика (80-100 мг/кг кетамина и 10-12,5 мг/кг ксилазина, см. Таблицу материалов) внутрибрюшинно.
2. Оцените животное на предмет адекватного седативного эффекта, ущипнув палец ноги. Наносите офтальмологическую мазь на глаза, чтобы избежать сухости роговицы. Перед процедурой введите анальгетик (0,03-0,06 мг/кг бупренорфина подкожно).
3. Поместите мышь на стереотаксическую рамку (см. Таблицу материалов) после подтверждения полной седации.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании газового анестетика поместите нос мыши в носовой конус, где она будет продолжать получать смесь изофлурана-O₂ во время процедуры (1,5%).
4. Удалите предыдущую скобу, затем удалите волосы либо с помощью крема для депиляции, либо путем бритья. Дезинфицируйте кожу чередующимися циклами скраба на основе хлоргексидина/бетадина и спирта. Затем с помощью стерильного скальпеля сделайте продольный разрез по средней линии длиной 1 см вдоль предыдущего хирургического рубца.
5. Прикрепите наконечник MIRS к стереотаксическому кронштейну через адаптер сцены/держатель наконечника для повышения устойчивости и точности.
6. Настройте станок MIRS (см. Таблицу материалов) с помощью следующих настроек (рис. 1).
   1. Вставьте шнур питания, установленный на задней панели, в розетку для шнура питания. Включите или выключите питание системы путем переключения (1 = ВКЛ, 0 = ВЫКЛ).
   2. Вставьте один конец азотного шланга (входящего в комплект поставки консоли) в штуцер с наружной резьбой на задней панели консоли. Поверните соединительную гайку по часовой стрелке, чтобы затянуть соединение.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Противоположный конец шланга должен быть подключен к подаче азота.
   3. Перед подключением шланга к источнику азота убедитесь, что давление подачи не превышает 100 фунтов на кв. дюйм изб., что является рекомендуемым входным давлением подачи для консоли.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Консоль будет генерировать собственную аспирацию при активации ножной педалью после подачи азота на консоль.
   4. Закройте крышку вакуумного порта и запечатайте его, чтобы избежать утечки в вакуумной системе. Любые утечки в системе аспирации повлияют на производительность консоли MIRS.
   5. Если во время настройки или заливки уровень аспирации ниже 17, убедитесь, что ручка аспирации на передней части консоли установлена на максимальный уровень (100), убедитесь в отсутствии утечек в системе аспирации и убедитесь в правильности давления подачи азота.
   6. Чтобы подсоединить ножную педаль к консоли, вставьте серый разъем ножной педали в ее серый гнездо до щелчка и встаньте на место.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Разъем ножной педали подключается к консоли в одной ориентации и имеет ключ.
   7. Чтобы подключить наконечник к консоли, вставьте синий разъем наконечника в его синюю розетку до щелчка и установите его на место.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Разъем наконечника подключается к консоли в одной ориентации, и он заперт ключом.
   8. Перед использованием системы подготовьте каждый наконечник, отасунув стерильную жидкость из небольшой миски в отверстие, через трубку и наконечник, а затем в канистру, чтобы убедиться, что внутренняя часть трубки и наконечника смазана для уменьшения окклюзии тканей.
   9. Подготовьтесь к аспирации в одиночку или к аспирации с резкой, выбрав соответствующий режим на передней панели консоли. Начните с помощью ножной педали.
7. Вставьте канюлю 23 G MIRS в отверстие для заусенцев на глубину 2,5 мм.
8. Начните процесс резекции, нажав на ножную педаль, подключенную к канюле. Выполните один полный цикл (360°) или более резекции с помощью ручки управления в наконечнике.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Чем больше циклов выполнено, тем больший объем опухолевой ткани резецируется.
9. После завершения процесса резекции извлеките канюлю MIRS 23 г из отверстия для заусенцев и используйте 5 мл 1x PBS для промывки трубки и удаления остаточного мусора.
10. Снимите мышь со стереотаксической рамки и закройте рану степлером или шовным материалом 4-0 (см. Таблицу материалов).
11. Поместите мышь на грелку или под согревающий свет во время восстановления после анестезии, прежде чем вернуть ее в клетку.
12. После завершения эксперимента продуйте канюлю с помощью промывки. Чередуйте с охлажденной средой и воздухом, чтобы «протолкнуть» всю резецированную ткань обратно в контейнер для сбора. Извлеките контейнер для сбора из системы и закройте прилагаемую крышку.
13. После выполнения шага 2.12 поместите дистальный конец канюли в 3% H₂O₂ и примените всасывание при 24-25 in Hg, чтобы заполнить линию отсасывания обратно к аспиратору и дайте постоять в течение 60-90 с. Промойте стерильным средством воздух и среду с перерывами.
14. Наблюдайте за мышами на предмет любых неврологических признаков (аномальных беспорядочных движений или судорог) после процедуры.

Результаты

Рисунок 1: Настройка системы MIRS. (A) Минимально инвазивная система резекции (MIRS) для опухоли головного мозга в моделях грызунов с интегрированной тканью система консервации. (B) Передняя панель консоли M...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Anased (инъекция ксилазина, 100 мг/мл)	Covetrus	33198
Анестезиологическая система	Patterson Scientific	78935903
контейнер для отходов анестезиологического газа	Patterson Scientific	78909457
C57Bl/6, 6-8-недельные мыши	Charles River Laboratories	Код штамма 027
Изофлуран	Covetrus	11695-6777-2
Изофлуран Вапорайзер	Patterson Scientific	78916954
кетамин	Covetrus	11695-0703-1
Kopf Stereotactic Frame	Kopf Instruments	5001
Легкопольный микроскоп	BioTek	Cytation 5
Установка для микроинъекций	Kopf	5001
Микромоторная дрель	Foredom	F210418
Система МРТ	Bruker	7T Biospec Avance III
Myriad System	NICO Corporation
Офтальмологическая мазь	Puralube vet мазь
Papain Sigma	Aldrich	#P4762
PBS	Invitrogen	#14190250
PenStrep	Millipore Sigma	N1638
Percoll solution	Sigma Aldrich	#P4937
Контроллер	пипеткиFalcon	A07260
Раствор повидона-йода	Aplicare	52380-1905-08
RPMI Media	Invitrogen	INV-72400120
Лезвие скальпеля	Covetrus	7319
Рукоятка скальпеля	Fine Science Tools	91003-12
Маркер для кожи	Time Out	D538,851
Степлер для снятия скоб	MikRon	ACR9MM
Степлер	MikRon	ACA9MM
Staples	Clay Adams	427631
Stereotactic Frame Kopf	Instruments	5000
Сахароза	Sigma Aldrich	S9378
Шовный материал, викрил 4-0	Ethicon	J494H

NICO